Internal  Analysis

Os 42 ratos foram aleatoriamente divididos em dois grandes grupos: Controle, com um número de 24 animais (n=24) e Teste, com um número de 18 animais (n=18).

O grupo Controle (n=24) foi subdividido nos grupos Água (n=12) e Isolipídico (n=12). O grupo Água foi subsequentemente dividido em dois grupos de 6 animais, o grupo Simulado - Água (Sim-Água) e o grupo Isquemia-Reperfusão - Água (IR-Água), e o grupo Isolipídico foi subsequentemente dividido em dois grupos de 6 animais, o grupo Simulado - Isolipídico (Sim-Isolipídico) e o grupo Isquemia-Reperfusão - Isolipídico (IR-Isolipídico), conforme mostra a figura 7:

Figura 7 – Grupos Controle: Simulado-Água (Sim-Água) e Isquemia-Reperfusão - Água (IR-Água); Simulado- Isolipídico (Sim-Isolipídico) e Isquemia-Reperfusão - Isolipídico (IR-Isolipídico).

Os ratos pertencentes ao grupo Água receberam água potável na dose de 0,01 ml/g de peso, administrada por via orogástrica, durante sete dias consecutivos, sempre no mesmo horário no período da manhã.

Os ratos pertencentes ao grupo Isolipídico receberam uma mistura oleosa rica em ácidos graxos ω-6 (ver quadro 2), na dose de 0,01 ml/g de peso, administrada por via orogástrica, durante sete dias consecutivos, sempre no mesmo horário no período da manhã.

Quadro 2 – Composição da mistura isolipídica Mistura Isolipídica = Óleos de Milho e Soja Óleo de milho

Óleo de soja

ALA (ωγ) 67,6mg/ml

Relação ω6:ω3 8:1

Relação ω9:ω6 0,4: 1

O grupo Teste (n=18) foi subdividido em três grupos de 6 animais: grupo Isquemia-Reperfusão-Mix 1 (IR-Mix 1), grupo Isquemia-Reperfusão-Mix 2 (IR-Mix 2), e grupo Isquemia-Reperfusão-Mix 3 (IR-Mix 3), conforme mostra a figura 8:

Figura 8 - Grupos Teste: Isquemia-Reperfusão – Mix 1 (IR-Mix 1), Isquemia-Reperfusão – Mix 2 (IR-Mix 2) e Isquemia-Reperfusão – Mix 3 (IR-Mix 3).

Os ratos pertencentes aos grupos IR-Mix 1, IR-Mix 2 e IR-Mix 3 receberam, conforme cada grupo, misturas oleosas respectivamente denominadas Mix1, Mix2 e Mix3, cujas composições se encontram descritas nos quadros 3, 4 e 5. Cada Mix foi administrado por via orogástrica, na dose de 1,2 g/Kg de peso/dia (correspondente à administração de 0,01 ml da formulação/g de peso), durante sete dias consecutivos, sempre no mesmo horário no período da manhã.

Todas as misturas oleosas foram fornecidas pela Nutrimed Industrial, sob a patente “Preparado à base de óleos vegetais usado como suplemento nutricional” – PI1000759-8.

Quadro 3 – Composição do Mix 1

Mix 1 = Oliva + Canola + Linhaça (ALA) Azeite de oliva Óleo de canola Óleo de linhaça Fonte de ωγ ALA (100%) = 116,7mg/ml Relação ω6:ω3 1,4: 1 Relação ω9:ω6 3,4: 1

Quadro 4 – Composição do Mix 2

Mix 2 = Oliva + Canola + Peixe (ALA + EPA + DHA) Azeite de oliva

Óleo de canola Óleo de peixe

Fonte de ωγ ALA (35%) + EPA (39%) + DHA (26%)

Relação ω6:ω3 1,4: 1

Relação ω9:ω6 3,4: 1

Quadro 5 – Composição do Mix 3

Mix 3 = Oliva + Canola + Linhaça +DHA (ALA + DHA) Azeite de oliva

Óleo de canola Óleo de linhaça DHA (algas marinhas)

Fonte de ωγ ALA (84%) + DHA (16%)

Relação ω6:ω3 1,4: 1

Relação ω9:ω6 3,4: 1

Após 60 minutos da sétima (última) administração orogástrica, tanto os animais que receberam água potável quanto os animais que receberam misturas oleosas, foram submetidos à técnica anestésica e aos procedimentos cirúrgicos propostos para cada grupo.

3.3.2 Técnica Anestésica

Primeiramente os ratos foram anestesiados por meio de uma associação de cloridrato de cetamina a 10% (Vetanarcol ®), na dose de 90 mg/Kg, e cloridrato de xilasina a 2% (Kensol ®), na dose de 10 mg/Kg, administrados simultaneamente, por via intramuscular,

na face ventral do membro pélvico traseiro esquerdo. Os animais foram considerados anestesiados quando ocorreu a perda dos reflexos córneo-palpebrais, bem como a perda do reflexo de retirada ao estímulo de preensão em membros pélvicos e torácicos.

Durante todo o procedimento, os ratos foram mantidos com temperatura retal entre 36,5ºC e 37,5ºC, conforme sugerido por Ozen et al. (2008), sob calor de lâmpada incandescente, quando necessário (ver figura 9). Os animais também foram observados em relação à ocorrência de cianose de extremidades ou de mucosas, ou ocorrência de hipersecreção.

Ao final do procedimento, 15 minutos antes da decapitação, foi repetido o ato anestésico com as mesmas drogas, nas mesmas doses, administradas simultaneamente por via intramuscular, na face ventral da pata traseira direita.

Figura 9 – Ratos Wistar anestesiados, com termômetro retal e sob luz incandescente.

3.3.3 Procedimentos Cirúrgicos

Os animais foram acomodados em bancada cirúrgica durante todo o procedimento. Na técnica cirúrgica foi utilizado instrumental microcirúrgico adequado.

Em todos os grupos de ratos, o procedimento se iniciou pela realização de uma cervicotomia mediana longitudinal anterior, com individualização das artérias carótidas comuns direita e esquerda a 0,5 cm de sua bifurcação em artérias carótidas interna e externa, como descrito por Muniz, Faria e Vasconcelos (2004). Conforme advertido por Nandagopal, Muralidharan e Thirumurugan (2011), durante a dissecção das artérias carótidas, teve-se o

cuidado de evitar uma estimulação indesejável ou uma lesão inadvertida dos nervos vagos (ver figura 10).

Figura 10 – Artérias carótidas comuns isoladas bilateralmente, com preservação dos nervos vagos. Nos grupos Sim-Água e Sim-Isolipídico, as artérias carótidas comuns foram isoladas com fios nylon 4-0, porém não se prosseguiu com o estabelecimento da isquemia. Após uma hora (período de tempo durante o qual foi mantida a isquemia nos demais grupos), foi realizada a sutura da incisão cervical com fio de nylon 4-0 e aguardado o período equivalente à “reperfusão”, por mais três horas, conforme demonstra a figura 11:

Figura11 – Linha do tempo dos procedimentos cirúrgicos realizados nos grupos Sim-Água e Sim-Isolipídico.

Após o período equivalente à isquemia e reperfusão (duração total de 4 horas), os animais de todos os grupos foram submetidos à craniectomia, com rápida abertura dural e extração do cérebro para análise.

3.3.4 Estabelecimento da Isquemia-Reperfusão Cerebral

Nos grupos IR-Água, IR-Isolipídico, IR-Mix 1, IR-Mix 2 e IR-Mix 3, foi realizada a individualização e oclusão bilateral simultânea das artérias carótidas comuns com clipes vasculares tipo bulldog, mantidos durante uma hora (ver figuras 12 e 13).

Figura 12 – Oclusão das artérias carótidas comuns. Figura 13 – Aplicador e clipes microvasculares.

Após o período de isquemia, os clipes vasculares foram removidos para permitir a reperfusão e foi realizada a sutura da incisão cervical com fio de nylon 4-0. A reperfusão perdurou por três horas, após a qual foi realizada a craniectomia (ver figura 14).

Figura 14 – Linha do tempo dos procedimentos cirúrgicos realizados nos grupos IR-Água, IR-Isolipídico,

3.3.5 Morte dos Animais e Extração Cerebral

A craniectomia levou à morte dos animais pela decapitação. Imediatamente, procedeu-se à craniotomia (abertura da caixa craniana) com delicada extração dos cérebros para análise (ver figura 15).

Figura 15 – Exposição do cérebro logo após a craniotomia.

3.4 Avaliação do Dano de Isquemia-Reperfusão