Inspirasjon og mote former ideen- fra ide til objekt

3.10.1. Antígeno de excreção e secreção de verme adulto de A. ceylanicum

Para a obtenção dos produtos excretados/secretados (ES) de adultos de A.

ceylanicum recuperados vivos da mucosa intestinal de hamsters infectados foram

lavados três vezes com solução salina tamponada estéril (PBS, pH 7,4). Em capela de fluxo laminar, as lavagens com PBS se repetiram mais duas vezes e, em seguida, foram lavados três vezes com meio RPMI 1640 (Sigma, EUA) suplementado com antibiótico/antimicótico 1% (Sigma, EUA) e 1,6% de l-glutamina (Synth, Brasil).

Após a lavagem, os vermes foram transferidos para tubos de 15 ml contendo meio de cultura RPMI 1640 em uma proporção de 10 vermes por mililitro de meio e, no máximo 5 ml por tubo. A cultura foi incubada em estufa a 37ºC e 5% de gás carbônico durante 48 h. A cada 12 h, o meio de cultura era renovado, sendo que o sobrenadante contendo os produtos ES foi retirado e armazenado a -20ºC. Ao final da incubação, os sobrenadantes coletados foram agrupados em tubos de 50 ml e os parasitos armazenados a -20ºC para a produção do extrato proteico total. Todos os procedimentos feitos durante a cultura ocorreram em capela de fluxo laminar em condições de esterilidade.

O meio de cultura coletado contendo os produtos ES dos parasitos foi centrifugado por 10 min., 1500 g, 4ºC, para retirada de ovos, restos celulares ou outras partículas em suspensão. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para um tubo Vivaspin 20 5kDa MWCO (GE Healthcare) para concentração dos produtos ES,

seguindo instruções do fabricante, até redução para 1-5% do volume inicial. Os produtos ES concentrados foram aliquotados em tubos de 1,5 ml e armazenados a -80ºC até sua utilização.

3.10.2. Preparação de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum

Os vermes adultos utilizados para a produção de antígeno ES foram utilizados também para a produção de antígeno bruto. O extrato proteico total de vermes adultos foi obtido através da maceração manual dos parasitos, com auxílio de pistilo de vidro e volume mínimo de PBS (pH 7,4). O homogenato foi transferido para tubos de microcentrífuga (1,5 ml). Em seguida, o extrato bruto foi sonicado utilizando aparelho de ultrassom (Branson Sonc Power – Sonofer Cell Disruptor 450), sendo realizados cinco ciclos de 30 segundos, com intervalos de 30 segundos em banho de gelo, com amplitude de 40%. Posteriormente, o extrato foi centrifugado a 3000 g, 4°C, por 15 minutos. O sedimento foi descartado e o extrato bruto solúvel foi aliquotado e armazenado a -80°C até o seu uso.

3.11. Dosagem de proteínas

As concentrações de proteínas presentes nas amostras de ES e de extrato proteico total de vermes adulto de A. ceylanicum foram estimadas conforme método descrito por Bradford (1976). A cada poço de uma placa de microtitulação (BD) foi adicionado 20 µl da amostra a ser dosada e 180 µl de reagente de Bradford [Coomassie brilliant blue R-250 0,1% (m/v) em solução aquosa com etanol 5% (v/v) e ácido fosfórico 10% (v/v), filtrado em papel filtro número 1)] (BioAgency). Sobre os poços foi acrescentado solução padrão contendo 0,5-2 µg de albumina sérica bovina - fração VI (Sigma) em 20 µl de água Mili-Q. A leitura realizada em um leitor de ELISA (Versamax Microplate Reader Tunable – Molecular Devices) com o comprimento de onda de 595 nm. A equação da curva padrão foi calculada pelo programa Excel (Microsoft Office).

3.12. ELISA

Placas de microtitulação de poliestireno (BD Falcon) foram sensibilizadas com 100 µl/poço da solução de extrato proteico total (1µg/ml ) ou de ES (5µg/ml) de A.

lavagens com PBS 0,15 M contendo Tween 20 a 0,05% (PBST 0,05%) foi realizado o bloqueio de sítios inespecíficos com solução de PBST 0,05% e caseína 3% (Molico, Nestlé) a temperatura ambiente por 90 minutos. Após nova lavagem o plasma dos hamsters foi utilizado diluído 1:100 (v/v), em duplicata e incubado por 18h, a 4° C . Repetida a lavagem com PBST 0,05% foi adicionado o conjugado biotinilado anti-IgG total de hamster (BD) na diluição de 1:5000 (v/v), incubado por 2h a 4° C. Após nova lavagem com PBST 0,05% foi adicionada a solução contendo estreptavidina (Sigma) diluída 1:3000 (v/v), em PBST 0,05% e Incubado a temperatura ambiente por 20 minutos. Após três lavagens com PBST 0,05%, a revelação da reação foi feita utilizando o cromógeno TMB (BD OptEIA®) e após 10 min. a reação foi interrompida utilizando solução de ácido sulfúrico 2M. A placa lida em espectrofotômetro (Versamax Microplate Reader Tunable – Molecular Devices) a 492 nm. Os valores de absorbância obtidos foram expressos pela média aritmética entre a duplicata de cada amostra. O cut- off foi determinado pela média das amostras negativas mais três vezes o desvio padrão. 3.13. Análise estatística

Para a análise estatisticamente significativa dos dados gerados foi utilizado o

software Graph Pad Prism 5. Para verificar a distribuição dos dados, foi utilizado o teste

Kolmogorov-Smirnov.

As análises entre dois grupos foram feitas com os métodos estatísticos teste T pareado ou não pareado (dados paramétricos) e Wilcoxon Matched Pairs ou Mann e Whitney (dados não paramétricos). Para análise de três ou mais grupos, os dados foram submetidos aos testes ANOVA ou Reapeated Measures ANOVA seguido do de Tukey (dados paramétricos) e Kruskal-Wallis ou Friedman seguido do teste de Dunns (dados não paramétricos). Foi utilizado o teste de Grubbs para detectar outliers (http://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm). Todos os resultados analisados foram considerados significativos quando apresentaram um valor de p < 0,05.

4. Resultados

4.1. Aferição de peso

Os animais foram pesados no inicio do experimento e posteriormente a cada sete dias (Gráfico 1). Aos 7 dpi não houve diferença no ganho de peso na comparação dos grupos infectados entre si ou com o grupo NI.

A partir de 14 dpi observa-se ganho de peso do grupo NI e perda de peso nos grupos 25 L3, 75 L3 e 125 L3. Houve diferença estatisticamente significativa significativa na comparação dos grupos NI com os grupos 25 L3 (p < 0,01); 75 L3 (p < 0,01); 125 L3 (p< 0,05) e 250 L3 (p < 0,01). Não houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos infectados.

Aos 21 dpi foi observado ganho de peso nos grupos NI e 25 L3. Houve perda acentuada de peso nos grupos infectados. Na comparação entre os grupos foi observada diferença estatisticamente significativa entre 125 L3 (p< 0,05), 250 L3 (p < 0,01) e NI, mostrando uma relação direta entre aumento de carga e danos causados ao hospedeiro.

0 7 14 21 70 80 90 100 110 120 130 25 L3 75 L3 125 L3 250 L3 NI Dias pós-infecção P es o e m g ra m as

GRÁFICO 1: Alteração de peso semanal dos grupos experimentais em gramas. Não infectado (NI); infectados com A. ceylanicum, por via oral 25 L3, 75 L3, 125 L3 e 250 L3. Dados apresentados em média.

4.2. Exame parasitológico de fezes 4.2.1. Ovos por grama de fezes (O.P.G)

A cinética de eliminação de ovos nas fezes dos grupos infectados com diferentes inóculos de A. ceylanicum está representada no gráfico 2B . A patência para todos os grupos foi observada aos 14 dpi. Os valores de O.P. G foram compatíveis com os

inóculos, ou seja o número de ovos eliminados pelo grupo 25 L3 foi menor que no grupo 75 L3 e este menor que o grupo 125 L. O grupo 250 L3 apresentou os maiores valores no exame.