O sistema imunológico humano pode ser dividido em duas partes: imunidade inata e adaptativa. O sistema imune inato reage dentro de minutos após o encontro com os agentes patogenicos invasores. Já o sistema imune adaptativo emprega ferramentas mais novas e mais personalizadas, demora dias ou semanas para gerar anticorpos e células T especializadas no combate aos patógenos (HOBOHM, 2009).
A imunidade inata é eficaz contra uma variedade de agentes infecciosos, que têm características comuns reconhecidas pelas células fagocíticas, mas não tem nenhuma memória imunológica contra a exposição anterior (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Ela é composta principalmente de células natural killer (NK), polimorfonucleares (PMN) e macrófagos e está diretamente envolvida na imunologia de tumores. Estas células também participam na resposta adaptativa e formam uma ponte importante e vital entre os dois ramos do sistema imune (RUSH; CUDRICI; NICULESCU, 2005).
A resposta imunológica adaptativa é caracterizada pela resposta imune humoral, mediada por anticorpos produzidos por linfócitos B, sendo que a resposta imune celular é mediada por linfócitos T, que reconhecem antígenos de microorganismos intracelulares, que são apresentados aos linfócitos por células apresentadoras de antígeno (APCs), por meio do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) , fazendo com que a célula infectada seja eliminada ou ativando células responsáveis por fagocitose. Os linfócitos constituem uma variada população, com especificidades na resposta imune adaptativa: células T auxiliares (CD4+), células T citotóxicas (LTC CD8+), células T reguladoras, Natural Killer (NK) e uma pequena população de células T que expressam uma molécula de superfície tipicamente encontrada em células NK (NKT) (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012).
As células T se subdividem em duas classes principais : linfócitos TCD4 e linfócitos TCD8, onde cada uma dessas moléculas irá possuir funções efetoras distintas. Essas moléculas
diferem entre si na classe de moléculas de MHC que reconhecem. Dessa maneira, células TCD8 reconhecem moléculas de MHC de classe I que estão presentes em praticamente todas as células nucleadas e as células TCD4 reconhecem moléculas de MHC de classe II que estão presentes nas células dendríticas, linfócitos B, macrófagos e outros tipos celulares como células epiteliais e endoteliais do timo, reconhecendo células infectadas por vírus ou células com mutações que
induzem neoplasias malignas, promovendo sua eliminação (HARARI et al. 2009; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Para que as células TCD4 ou TCD8 exerçam suas funções é
necessário que haja a ativação da célula T virgem. Sendo assim, para que as células T CD4 ou TCD8 virgem se tornem ativadas é necessário que haja a formação de dois sinais: o primeiro sinal e o segundo sinal (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012).
O primeiro sinal é dado através da ligação da molécula de MHC com o TCR (receptor de superfície de célula T). O TCR tem a capacidade de reconhecer moléculas processadas e
apresentadas através do MHC-I expresso em grande parte das células. Porém, somente o
primeiro sinal não é necessário para ativar as células T, pois se somente ele existir vai haver a formação de células T anérgicas (YIN et al., 2011; STEWART-JONES et al., 2012). Portanto, se faz necessário um segundo sinal que se dará através da ligação de co-estimuladores, do
receptor CD28, expresso em linfócitos T virgens a B7-1 ou B7-2 presentes nas APCs (KAUFMANN; WALKER, 2009). Após a ativação das células T, elas darão origem a células
T de memória e a células T citotóxicas, que vão eliminar não somente as células alvo infectadas, mas também as células tumorais (MORISHIMA et al., 2010; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI,
Porém, a ativação completa da célula TCD8 virgem e sua diferenciação em célula T citotóxica (LTC), e célula TCD8 de memória pode exigir a participação de células TCD4+. O que ditará se a célula TCD4 participará ou não na diferenciação das células TCD8, será o tipo de exposição antigênica. Caso haja uma resposta acentuada do sistema imune inato ao microoganismo, ou caso a APC tenha sido infectada diretamente pelo patógeno ou se a apresentação cruzada do antígeno microbiano for eficaz, pode não ser necessário o auxílio das células TCD4. Entretanto, se há algo que tende a desencadear uma resposta imunológica fraca como por exemplo as células tumorais que tem a capacidade de ocultar ou até mesmo não expressar as moléculas de MHC, nesse caso há a necessidade do auxílio das células TCD4 para a ativação das células T citotóxicas. A ativação de células T CD8+ e sua diferenciação em
linfócito T citotóxico (LTC) CD8+ requer a participação de diversas citocinas, principalmente a interleucina 2 (IL-2), liberadas por células T CD4+ (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Além disto, as células TCD8 fazem com que a resposta a infecções e contra tumores, sejam mais eficazes, por meio da secreção do fator de necrose tumoral (FNT) e do Interferon- (IFN-
), promovendo o aumento da expressão do MHC-I e facilitando a morte de células infectadas
ou alteradas (HARARI et al. 2009).
LTCs medeiam sua atividade lítica por meio de dois mecanismos: citotoxicidade dependente de grânulos e citotoxicidade dependente do receptor de morte célular. A via dependente de receptor de morte é ativado pela interacção entre CD95 (FAS), factor de necrose tumoral (FNT) e os ligantes expressos nas superfícies das células citotóxicas. O principal mecanismo citotóxico é representado pela citotoxicidade dependente do grânulo. Os grânulos citotóxicos contêm perforina (proteína formadora de poros) e várias proteases associadas aos grânulos, incluindo as granzimas. Após o reconhecimento da célula alterada pelo linfócito T CD8+, ocorre a indução da secreção de grânulos citotóxicos, conduzindo à morte célular (CHOWDHURY; LIEBERMAN, 2008).
Grande parte dos tumores não são capazes de iniciar respostas imunes dos linfócitos T, por não apresentarem co-estimuladores (APCs que expressam moléculas além do antígeno exigido para ativação da célula T). Portanto, acredita-se que as APC do hospedeiro ingerem células tumorais, que então são capazes de apresentar peptídeos específicos por meio do MHC- I, que são reconhecidos por células T CD8+. Autores têm sugerido que a presença de LTC CD8+ em tumores, pode estar relacionado com um melhor prognóstico (ZANCOPE et al. 2010; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Mlecnik et al. (2011) ao analisarem amostras de pacientes com câncer de coloretal, observaram que o crescimento do tumor primário e a
Slebioda et al. (2011) ao estudarem o receptor TNFRSF25, da família dos receptores FNT que liga-se à proteína TL1A, analisaram o efeito de desencadeamento TNFRSF25 em células T transgênicas OT-I TCR, e demonstraram que TNFRSF25 juntamente com TL1A solúvel promove a proliferação e acumulação de células T CD8+ antígeno-específicas, assim como sua diferenciação em LTCs, contribuindo para uma resposta antitumoral. Esses autores sugerem que agonistas TNFRSF25, tais como TL1A solúvel, poderia ser usado para melhorar a imunogenicidade das vacinas que visam obter células T CD8 + anti-tumorais em humanos .
2.3.2 Células NK
Células natural killer (NK) são uma classe de linfócitos caracterizados por um largo espectro de funções efetoras que vão desde a morte de células alvo, principalmente células tumorais e infectadas por vírus, até a capacidade para influenciar várias fases da resposta imunitária (MORETTA et al., 2003; FERLAZZO, 2005; FINK et al., 2007; VIVIER et al., 2011; MORANDI et al., 2012) bem como o envolvimento na formulação de respostas imunes adaptativas através da produção de citocinas e quimiocinas (LANIER, 2008; VIVIER et al., 2008).
A principal citocina produzida pelas células NK é o Interferon- (IFN- ) em várias condições fisiológicas e patológicas. Essas células também produzem uma variedade de outras citocinas tanto pró-inflamatórias quanto imunossupressoras, como: fator de necrose tumoral-α (FNT-α) e interleucina 10 (IL-10), fatores de crescimento, tais como GM-CSF (Fator de estimulação de colônias de macrofágos granulócitos), G-CSF (factor de estimulação de granulócitos colónia) e IL-3. As Células NK também secretam vários tipos de quimiocinas como: CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP1-α), CCL4 (MIP-1 ), CCL5 (RANTES), XCL1 (lymphotactin) e CXCL8 (IL-8) (WALZER et al., 2005).
As células NK são caracterizadas pela falta de expressão do receptor CD3 e pela expressão dos receptores CD56 e CD16, sendo, dessa forma, células CD3- CD56+ CD16+ (EAST; KENEDDY; WEBB, 2012). Estas células são fenotipicamente e funcionalmente heterogêneas podendo ser divididas de acordo com o nível de expressão de CD56 e CD16 em dois grandes subconjuntos: CD56high CD16low e CD56low CD16high. Células NK CD56high CD16low representam aproximadamente 10% das células NK encontradas no sangue e podem produzir grandes quantidades de citocinas e quimiocinas, dentro de minutos após a sua ativação, no entanto, possuem pouca ou nenhuma capacidade para matar células tumorais espontaneamente (COOPER et al., 2001). Por outro lado, as células NK CD56low CD16high,
representam 90- 95% de todas as células NK maduras possuindo menor capacidade de produção de citocinas em resposta à ativação e maior lise de células malignas (FERLAZZO; MUNZ, 2004; WALZER et al., 2007).
Acredita-se que o equilíbrio entre os sinais de ativação e inibição que as células NK recebem dos seus receptores de superfície determina o seu destino funcional (JEWETT et al., 2011). A ativação depende de um balanço feito entre receptores de ativação e de inibição existentes nessas células (KRZEWSKI; COLIGAN, 2012). De modo geral, os receptores de ativação reconhecem ligantes em células infectadas e danificadas, e os receptores de inibição reconhecem ligantes que são normalmente expressos nas células saudáveis normais (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012). Entre os receptores de ativação o NKG2 é o mais comum e interage com vários ligantes que são expressos em baixos níveis na maior parte dos tecidos, mas são superexpressos no início do dano celular em resposta a danos ao DNA. Este receptor possui afinidade por uma família de proteínas semelhantes à MHC-I , que são encontradas em células infectadas por vírus e células tumorais (RAULET; GUERRA , 2009). O CD16, NKp46, NKp44, NKp30 são outros tipos de receptores de ativação conhecidos que se conectam a moléculas que têm em suas caudas citoplasmáticas os motivos de ativação à base de tirosina do imunoreceptor, baseados em tirosina (ITAMs) (EAST; KENEDDY; WEBB, 2012).
Existem três famílias principais para os receptores de inibição. A família dos receptores imunoglobulina-símile de células killer (KIR), que reconhecem diferentes alelos de moléculas de HL-A, B e C. A família dos transcritos semelhante à Ig (ILTs), onde destaca-se o ILT-2, que têm especificidade variada para vários alelos MHC-I,e a família de receptores de inibição NK, que possuem função de vigilância para a não expressão de moléculas de HLA-E, MHC-I e HLA-G (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012).
A função efetora das células NK é matar células infectadas e ativar os macrófagos para destruição dos microrganismos fagocitados. O principal mecanismo efetor das células NK é a citólise da célula-alvo mediada principalmente pela liberação de serglicina, granzima e perforina (BERNARDINI; GISMONDI; SANTONI, 2012). A serglicina é um proteoglicano sulfatado que serve como arcabouço para conter granzimas e perforina em grânulos. Quando as células Nk são ativadas, a exocitose de seus grânulos liberam essas proteínas nas proximidades das células-alvo. Uma das proteínas presentes nos grânulos da célula NK, é a perforina que produz poros na membrana citoplasmática das células-alvo, facilitando a entrada das granzimas no citosol por meio desses poros. As granzimas são enzimas que iniciam a sequência de eventos de sinalização que provocam a morte das células-alvo por apoptose. A morte celular se dá através da geração de derivados reativos do oxigênio (iNOS), dano mitocondrial ou
fragmentação de DNA, e ainda através de mecanismos relacionados ou não a atividade das caspases (principalmente a família Bcl-2), bem como moléculas relacionadas a ativação de sinais de morte (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2012; HAZELDINE et al., 2012; KRZEWSKI; COLIGAN, 2012).
As células NK reconhecem a célula-alvo especialmente através de alterações na expressão de MHC-I. O MHC-I está constitutivamente presente nas células e sua interação com o receptor inibitório das células NK promove o reconhecimento da célula normal. Porém, por questões de ordem biológicas, algumas células tumorais se mostram com expressão reduza ou não expressam o MHC-I, razão de não serem reconhecidas pelas células T. Logo a célula NK receberá do seu receptor maior ativação ao seu ligante na célula tumoral (LOPEZ-VÉRGES et al., 2011).
O antígeno CD-57 é uma molécula de hidrato de carbono também conhecida como beta- 1, 3-glucuroniltransferase 1 (B3GAT1), que foi descrito, pela primeira vez, em 1982, em células natural killer em humanos e que, também, é chamado de HNK-1, LEU-7 ou L2 (ABO; BALCH, 1982; LAI et al., 1998; SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006). É expressa em 15% a 20% das células mononucleares do sangue periférico, dentre as quais, cerca de 60% correspondem a células NK CD56lowCD16high e células T ativadas (SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006).
A expressão de CD57 também é encontrado em linhagens de linfócitos T, sendo considerado como um marcador de senescência replicativa ou exaustão clonal, que resulta da estimulação contínua por antigenos e/ou citocinas em pacientes com estimulação crônica de células T (WOOD; TWIGG; DOSEFF, 2009). Embora o CD57 seja expresso geralmente como marcador de senescência em células T CD8 + estudos mostram que a sua expressão pode ser em resposta a outros estímulos (BRENCHLEY et al., 2003; FOCOSI et al., 2010). Logo, a expressão de CD57 está ligada à maturidade de células TCD-8 e a células NK. Células NK fetais e neonatais não expressam ou expressam pouca quantidade de CD57 (ABO et al., 1981; LOPEZ-VIRGÈS et al. 2010). A expressão do CD57 sobre as células NK aumenta com idade (MERINO et al., 1998).
A expressão do CD57 na célula NK pode sugerir o seu estado de ativação já que este é um marcador de células em estágio de maturação avançado, que já passaram por inúmeras divisões, provavelmente em resposta a agentes patogênicos ou citocinas (SOLANA; PAWELEC; TARAZONA, 2006). Lopes-Vergès et al. (2010) com o objetivo de avaliar as
diferenças fenotípicas, funcionais e de transcrição entre CD57+ e CD57- em células NK
IL-2, passariam a expressar CD57. Os resultados revelaram que após a estimulação com IL-2 por 5 dias cerca de 30% das células NK passaram a ser CD57+ CD56low. Portanto, as células NK passam a expressar CD57 após estimulação e marca a transição para estágios de maturação mais avançados das células NK. A capacidade proliferativa das células CD57+ também foram analisadas neste estudo e os autores concluíram que estas células possuíam uma menor capacidade proliferativa quando comparadas à CD57-.
Além de possuir uma menor atividade citolítica e um menor poder de proliferação, as células NK CD57+ tem uma resposta diminuída a citocinas e também produzem uma menor quantidade destas. Essas características sugerem que essas células podem estar relacionadas a mecanismos imunorregulatórios do sistema imune (BJÖRKSTRÖM; JUNGGREN; SANDBERG, 2010; LUTZ et al., 2011).
2.4 A INFLUÊNCIA DO TCD-8 E DAS CÉLULAS NATURAL KILLER (CD-57) NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
O Câncer surge a partir da disseminação descontrolada de clones de células transformadas , as quais devem ser reconhecidas pelo sistema imunológico antes de serem transformadas em um tumor . Embora tenha sido demonstrado que o sistema imune reage para muitos tumores e , pelo menos, retarda a progressão , não é ainda bem conhecido como reações imunológicas são usados para destruir tumores de uma forma específica . Além disso, é preciso levar em conta a capacidade das células tumorais de evadir ou superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (COUSSENS; WERB , 2001).
A presença de células inflamatórias dentro do microambiente tumoral exerce um papel dual podendo contribuir tanto para a progressão ou para a inibição do crescimento do tumor (VISSER; COUSSENS, 2005; OLIVEIRA-NETO et al., 2007). Estudos recentes sugeriram que a qualidade, e não a quantidade, do infiltrado inflamatório é o determinante mais importante para o prognóstico (CURIEL et al., 2004). Para Zancope et al. (2009) as células T CD8+ e NK são as mais efetivas no combate ao câncer, contribuindo para um melhor prognóstico e maior sobrevida do paciente.
Vários estudos demonstraram que a infiltração de linfócitos T correlaciona-se significativamente com um tempo prolongado de sobrevivência dos pacientes refletindo em um melhor prognóstico, pelo menos em certos tipos de câncer como o de ovário e colo-retal (SATO et al., 2005; GALON et al., 2006). O papel positivo das células TCD8 na imunidade antitumoral ocorre em estágios precoces do câncer, onde nessa fase o tumor poderia aumentar o repertório
de células T e promover mais células T estimuladas por antígenos dentro do tumor (YU; FU, 2006).No entanto, a capacidade dos linfócitos T como células efetoras pode ser afetada pelo microambiental tumoral (YU; FU, 2006; BOISSONNAS et al., 2007) Da mesma forma, a migração de linfócitos antitumorais para o local do tumor pode ficar comprometida uma vez dentro do ambiente tumoral, ou pode adaptar-se adversamente ao ambiente supressor para promover o crescimento em vez de regressão. Os tumores frequentemente formam uma barreira que limita a infiltração de células T e reduz a drenagem de antígenos tumorais para os linfonodos (YU; FU, 2006).
Em carcinomas coloretais, a presença dos linfócitos TCD8 poderia estar correlacionada com um aumento da sobrevivência global (NAITO Y et al., 1998). Em contraste, a presença de LTCs ativados foi positivamente correlacionada com a agressividade da doença e com a redução da sobrevida global em pacientes que sofrem de linfomas de Hodgkin e não-Hodgkin (TEN BERGE et al., 1999).
Schumacher et al (2001) em um estudo retrospectivo investigou se existia uma ligação entre a infiltração de células T CD8 + e o risco de morte para o câncer de esôfago. Os autores referidos concluíram que a presença das células T CD8 em carcinomas de esôfago está associada a um fator prognóstico favorável que deve terimplicações diagnósticas e terapêuticas.
O papel das células NK no combate a disseminação de células neoplásicas tem sido demonstrado por muitos autores, que correlacionam inversamente a densidade e atividade citolítica das células NK, com a presença de metástase regional e à distância em CE. Quanto maior a presença de células NK circulantes , menores são as chances de desenvolver metástases (ZANCOPE et al., 2010). Nos pacientes com tumores livres de metástases regionais é observado uma redução em quase todas as células do sistema imunológico, exceto os linfócitos CD-57 (GIROLAMO et al., 2008).
O sistema imune através das células NK tentam controlar o crescimento tumoral, porém uma série de fatores responsáveis pela supressão da citotoxicidade de células NK em tumores humano tem sido identificados. Muitos mecanismos foram propostos para a inativação funcional das células NK associados a tumores, incluindo o aumento da expressão do ligante do receptor de morte Fas, a perda de RNAm para a granzima B (MULDER et al., 1997), e diminuição de CD16 e da sua cadeia zeta associada (NAKAGOMI et al., 1993). Uma vez que a maioria das células NK perdem a atividade citotóxica em pacientes com câncer, podem eventualmente, contribuir em vez de interromper a progressão do câncer, permitindo o crescimento e expansão de células tumorais.
Türkseven e Oygür (2010) estudando uma amostra com 46 casos de CE tratados imunoistoquimicamente pelo CD57, selecionado como indicador de células NK, mostraram que a densidade de células CD57+ , foi menor em tumores gradados como sendo o de pior prognóstico,quando comparado com os casos de melhor prognóstico .
Zancope et al. (2010) avaliaram as populações de células TCD8 e células NK, através da imunoexpressão do anti-CD8 e do anti-CD57 respectivamente, em amostras de CEO, CE de lábio, leucoplasias, queilite actínica e mucosa oral saudáveis. Em seus resultados os autores observaram que a quantidade de células TCD8 e células NK peritumoral e intratumoral, foram maiores em CE de lábio, quando comparado ao grupo controle, lesões pré-malignas e o CEO. A maior proporção de células TCD8 + peritumoral demonstraram correlação com um menor índice de proliferação neoplásica. Além disso, pacientes com CEO com elevada densidade de células T CD8 + peritumorais, mostraram uma tendência maior no tempo de sobrevida.
Existe poucos estudos analisando a presença de células TCD8 e células NK em CE de lábio e sua relação com a progressão da lesão. Esta pesquisa contribuiu para um melhor entendimento da influencia dessas células inflamatórias no prognóstico de CE de lábio, muito embora reconhecendo a necessidade da realização de estudos mais aprofundados nessa área.
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho avaliou imunoexpressão dos linfócitos T CD8 e das células NK em uma série de casos de CE de lábio inferior metastático e não-metastático, com a finalidade de relacionar os resultados obtidos com os aspectos clínico-patológicos especificamente, em relação ao estadiamento clínico TNM, gradação histopatológica de malignidade e fatores prognósticos. Com o objetivo de compreender melhor a patogênese dessas células inflamatórias no microambiente tumoral.