1.2.11.1 Diagnóstico Sorológico
A reatividade de anticorpos pode ser detectada para uma grande variedade de epítopos virais, correspondendo tanto a proteínas estruturais como proteínas não-estruturais do VHC (STRAUSS, 2001). Testes ELISA são fáceis de executar e baratos. Acredita-se que a sensibilidade do screening de pacientes realizado por esse teste varie de 98 a 100%. Um dos problemas desta técnica é a possibilidade de resultados falsamente negativos devido ao período de janela imunológica necessário ao aparecimento dos anticorpos. Da mesma forma, indivíduos imunocomprometidos também têm uma maior possibilidade de obterem resultados falsamente negativos (PAWLOTSKY, 1999).
O teste RIBA é utilizado para confirmar resultados positivos no teste ELISA e tem por base a detecção de anticorpos anti-VHC a partir da ligação desses a antígenos virais fixados em membranas de nitrocelulose (MUNOZ ESPINOSA, 2002). De acordo com Pawlotsky (1999), este teste não é útil ao diagnóstico das infecções pelo VHC em laboratórios clínicos, por não apresentar nenhuma informação adicional ao ELISA. Por outro lado, esse método pode ser utilizado na análise de soroconversões e é muito importante para o diagnóstico do VHC em bancos de sangue (PAWLOTSKY, 1999).
O ensaio imunoenzimático para o antígeno do core do VHC foi desenvolvido recentemente e sua eficiência tem sido comparada `a do teste qualitativo para o vírus (REDDY et al., 2006). A pesquisa desse antígeno tem sido utilizada, principalmente, no acompanhamento do tratamento de pacientes, visto que os níveis de antígeno do core podem
ser correlacionados às concentrações de RNA viral presentes no soro dos indivíduos infectados e, consequentemente, podem ser usadas como marcadores da replicação viral (BUTI et al., 2004).
1.2.11.2 Diagnóstico por Cultura de Células
Por muito tempo, um modelo de cultura de células plausível para a replicação do VHC não foi possível. Diversas linhagens celulares foram testadas, mas não havia um tipo de célula ideal que permitisse o isolamento viral para fins de pesquisa ou diagnóstico (BARTENSCHLAGER et al., 2003).
Contudo, a partir de 2003, foi proposto um modelo de cultivo celular para estudo do VHC (TOMASSINI et al., 2003). Para que este modelo fosse possível, foram feitas alterações na estrutura do genoma do VHC. Estas pequenas alterações visam facilitar a adequação viral ao meio de cultivo in vitro. Este complexo já funciona bem e permite que se descubra cada vez mais informações a respeito de características ainda obscuras com relação ao VHC, como forma de replicação e funções de algumas proteínas virais (AIZAKI et al., 2004). Entretanto, esse modelo de complexo replicativo só é utilizado para fins de pesquisa. Como o vírus utilizado nestes estudos é um vírus mutante, o vírus infectante presente em um indivíduo infectado continua sendo incapaz de se replicar em meios normais de cultivo celular.
1.2.11.2 Diagnóstico Qualitativo do VHC
A Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) é a ferramenta de biologia molecular mais facilmente utilizada no diagnóstico de doenças. Caracteriza-se por possibilitar diagnóstico rápido, sensível e específico. A principal dificuldade na adequação da técnica de PCR para o VHC foi a escolha dos iniciadores a serem utilizados na reação.
Okamoto e colaboradores (1990) analisaram vários iniciadores para reações de PCR, os quais eram localizados em diferentes regiões do VHC tais como: região 5’ não- codificante do genoma do VHC, região do core, região codificante da proteína NS1, região codificante das proteínas NS3 e NS4 e região codificante da proteína NS5. Seus estudos concluíram que a região não-codificante do genoma viral é a área mais conservada entre os diferentes tipos e subtipos do VHC, tornando-se, assim, a região mais adequada à pesquisa do RNA do VHC por PCR. A utilização de uma segunda PCR aumenta dez vezes a eficiência do teste, promovendo sensibilidade de 10U/mL.
Já a hibridização in situ é utilizada para detectar presença do RNA do VHC em esfregaços de células mononucleadas a partir de sangue periférico (BRÉCHOT, 1997). Essa técnica não é muito utilizada, não havendo muitos estudos que constatem sua eficácia.
O “HCV Qualitative TMA” é um teste disponibilizado comercialmente pela Corporação Bayer. Esta técnica é baseada em três passos: captura da seqüência alvo, amplificação desta seqüência e detecção do produto amplificado. A detecção é feita utilizando- se sondas complementares ao fragmento amplificado marcadas com quimioluminescência, sendo o resultado obtido a partir da interpretação do sinal quimioluminescente (KHAN et al., 2004).
O teste “AMPLICOR HCV MONITOR” é um teste comercial que baseia-se na transcrição do RNA viral para produção do cDNA, amplificação por PCR deste cDNA alvo usando iniciadores específicos do VHC, hibridização dos produtos amplificados com sondas oligonucleotídicas específicas do alvo e detecção dos produtos amplificados e fixos à sonda por determinação colorimétrica (AMPLICOR HCV MONITOR TEST V 2.0, Roche Diagnostic Systems, Germany).
1.2.11.3 Genotipagem Viral
A incapacidade de detecção da existência de co-infecção por diferentes genótipos ou subtipos é um problema geral encontrado nas diversas técnicas de genotipagem do VHC. Até mesmo o seqüenciamento que mostrou-se a técnica mais sensível, é ineficiente na determinação de co-infecções (HAUSHOFER et al., 2003).
A técnica de RFLP baseia-se na amplificação da região 5’não-codificante do RNA viral, com conseqüente digestão do produto amplificado. As enzimas HaeIII e RsaI combinadas com as enzimas MvaI e HinfI seriam as responsáveis pela diferenciação das amostras em genótipos. A diferenciação entre os subtipos 1a e 1b ocorreria pela utilização da enzima BstUI, enquanto que a diferenciação em subtipos 2a ou 2b se daria pela utilização da enzima ScrFI. A técnica não diferencia os subtipos do genótipo 2 em a, b e c (DAVIDSON et al., 1995).
O teste comercial LiPA, baseia-se na hibridização dos produtos amplificados com sondas específicas para os diferentes genótipos virais. No caso, utilizam-se primers biotinilados para amplificação do material viral na região 5’não-codificante. O DNA produzido a partir do RNA viral é hibridizado por sondas oligonucleotídicas imobilizadas. As sondas encontram-se ligadas a uma fita de nitrocelulose e são específicas para a região 5’ dos diferentes genótipos do VHC. Utiliza-se um conjugado para revelação da hibridização. A
banda da fita que der resultado colorimétrico corresponde ao genótipo do vírus (COMANOR et al., 2003).
A genotipagem do VHC por técnica de seqüenciamento é realizada por análise das seqüências da região 5’ não-codificante ou, até mesmo, da região hipervariável codificadora da proteína do envelope E2. Esta técnica pode ser feita por diferentes kits de seqüenciamento e seus respectivos aparelhos (MÜLLER et al., 2003; ELAHI et al., 2003 e BRÉCHOT, 1997). As técnicas de seqüenciamento são consideradas mais sensíveis para uso em grandes rotinas quando comparado com os testes de hibridização (HAUSHOFER et al., 2003), todavia o custo é mais elevado.
1.2.11.4 Diagnóstico quantitativo do VHC
Métodos para medição da carga viral têm utilizado PCR quantitativa e um teste de “branched” DNA. Todavia, é necessário definir clinicamente a relevância dos níveis virais de VHC e padronização destes níveis em unidades internacionais, para que eles possam ter aplicação clínica e em pesquisa (PAWLOTSKY et al., 2000). O conhecimento da carga viral é importante para o acompanhamento da eficácia do tratamento. A quantificação da carga viral, no entanto, não é um indicador da gravidade da doença (PAWLOTSKY, 2002).
O Teste AMPLICOR HCV MONITOR utiliza na amplificação, junto com a amostra a ser quantificada, um Padrão de Quantificação do VHC que é uma cópia transcrita de RNA não-infecciosa que contém locais de fixação ao iniciador idênticos aos do RNA alvo do VHC e uma região única de fixação da sonda que permite que o amplicon do Padrão de Quantificação se distingua do amplicon do VHC. Os níveis de RNA do VHC presentes nas amostras de teste são determinados comparando o sinal do VHC com o sinal do Padrão de Quantificação em cada amostra (AMPLICOR HCV MONITOR TEST V 2.0, Roche Diagnostic Systems, Germany).
A RT-PCR Competitiva é um método in-house baseado na co-amplificação competitiva de seqüências alvo específicas junto a padrões internos de concentração conhecida em um mesmo tubo de reação. É usado um competidor thio-RNA mutado, estável e resistente a Rnases, como controle interno. Depois de transcritos e amplificados, os produtos são digeridos com BamH1 e é feita eletroforese em gel de agarose. A quantificação é dada a partir da densidade ótica das bandas visualizadas no gel, medidas sob luz ultra-violeta e usando um sistema próprio para análise. A intensidade da fluorescência emitida pelo brometo de etídio associado ao DNA é proporcional à quantidade de DNA. Em estudos realizados, o teste mostrou-se tão sensível quanto o “real time” e mais sensível que o ensaio Amplicor HCV Monitor (HAZARI et al., 2004).
Dentre os testes disponibilizados para quantificação do RNA do VHC, o Real Time PCR é o teste com menor limite de detecção (350 cópias/mL) sendo, portanto, o mais sensível (MANCINI et al., 2004). No entanto, o custo da máquina, da sonda, do kit fluorescente e de outros reagentes necessários para a implementação da técnica, torna o método muito caro e inacessível para diagnóstico de pequenas rotinas (HAZARI et al., 2004).