Em 2007, Ribeiro et al estudaram o transcriptoma de glândula salivar de fêmeas
do mosquito Ae. aegypti, no qual foram encontrados três inibidores hipotéticos do tipo
serpina (sendo dois deles com função desconhecida), uma cistatina e um inibidor do tipo Kazal que foi identificado em glândula salivar de fêmeas e machos, e em carcaça de fêmeas. Este inibidor tipo Kazal apresentou similaridade com inibidores de trombina (Ribeiro et al., 2007). Com o objetivo de confirmar a atividade inibitória de
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2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram a clonagem, expressão, purificação e caracterização do inibidor tipo Kazal encontrado em transcriptoma de glândula salivar de Ae. aegypti, denominado AaTI (Aedes aegypti trypsin inhibitor). Para alcançar
estes objetivos foram necessários:
• Construção de oligonucleotídeos baseados na sequência depositada no banco de dados pelo Dr. José M. Ribeiro sob o número de acesso DQ440176.
• Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o AaTI em vetor de expressão pPIC9 para levedura Pichia pastoris.
• Transformação de leveduras P. pastoris e expressão do AaTI recombinante
(rAaTI) e do inibidor truncado (rAaTI∆) sem a cauda C-terminal carregada
negativamente.
• Purificação do rAaTI por cromatografias de afinidade e gel filtração.
• Caracterização cinética do inibidor purificado sobre diferente serinoproteases
de mamíferos e tripsinas de fêmeas adultas de Ae. aegypti pós-alimentadas.
• Testes de tempos de coagulação e agregação plaquetária utilizando o rAaTI purificado. Ensaios de competição do rAaTI pelo exosítio I e II da trombina para identificar em que exosítio o rAaTI se liga.
• Análise do perfil de transcrição do gene de AaTI em diferentes fases de vida e tecidos do mosquito Ae. aegypti.
• Identificação da presença de rAaTI nativo em intestino de fêmeas alimentadas por Western blotting utilizando anticorpos policlonais contra rAaTI.
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o inibidor de tripsina de
Aedes aegypti (AaTI) e o inibidor truncado (rAaTI∆)
3.1.1 Construção de oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos específicos foram construídos baseando-se na sequência de nucleotídeos que codifica para o AaTI, depositada no banco de dados pelo Dr. José M. Ribeiro (NIH – Rockville, MD, USA) sob o número de acesso DQ 440176. No
oligonucleotídeo forward 5’ AGCTCTCGAGAAAAGAGAGAGAGGAGTTTGTGC – 3’
(pPICXhoF) foi inserido um sítio de restrição para a enzima XhoI. No oligonucleotídeo reverse (pPICNotR) 5’ – TTTTCTTTTTGCGGCCGCTCAATACTCCTGTGGGATGAAG
– 3’ foi inserido um sítio de restrição para a enzima NotI. Para o inibidor truncado, foi
utilizado o mesmo oligonucleotídeo forward e como reverse o oligo pPICNotR∆, cuja
sequência é 5’ - TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCAGTTGTCACATGCTTG – 3’, no qual também foi inserido um sítio para a enzima de restrição NotI.
3.1.2 Amplificação e purificação do fragmento de DNA obtido por reação de polimerase em cadeia (PCR)
Utilizando os oligonucleotídeos construídos e como molde um produto de PCR gentilmente cedido pelo Dr Ribeiro contendo o AaTI, foi amplificado, por PCR, um
fragmento de DNA que codifica o inibidor AaTI e o inibidor truncado AaTI∆. As
condições foram: 5 min a 94°C seguido por 35 ciclos de [denaturação (94°C por 40 s), anelamento (55°C por 50 s) e polimerização (72°C por 50 s)] e uma etapa final de
PTC-200 (MJ Research – Minnesota, USA) na presença de tampão tris-HCl 100 mM,
pH 8,8 contendo KCl 500 mM e Nonited P40 0,8%, MgCl2 1,5 mM, dNTP (0,2 mM) e
enzima Taq polimerase (1U) (Fermentas – Vilnius, Lituânia). O produto do PCR foi aplicado em um gel de agarose 1% em TAE (tampão tris-acetato 40 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) e a visualização da banda de DNA foi realizada na presença de brometo de etídeo em luz UV. A banda foi recortada e extraída do gel utilizando o kit QIAEX II (QIAGEN - Germany) segundo as especificações do fabricante.
3.1.3 Reação de sequenciamento do fragmento de DNA amplificado
O sequenciamento automático de DNA foi realizado utilizando-se o kit
DYEnamic ET* Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences – Sweden)
segundo as instruções do fabricante. As condições do PCR foram: 95° por 10 s seguidos de 30 ciclos de 95°C durante 20 s; 56,5°C por 15 s e 60°C por 1 min. Para cada reação de sequenciamento foram utilizados 3 µL de DNA purificado, 1 µL de oligonucleotídeo pPICXhoF, pPICNotR ou pPICNotR2 5 pmol/µL, 1,5 µL do tampão
de sequenciamento (tris-HCl 160 mM, pH 9,0, contendo MgCl2 4 mM), 2,5 µL de
DYEnamic e água estéril para completar o volume de 10 µL. Os produtos da reação foram precipitados com 25 µL (2,5 volume) de etanol absoluto na presença de 1 µL (0,1 volume) de acetato de potássio 2,77 M contendo EDTA 0,25 M. A solução foi
centrifugada por 20 min a 15 700 g, o sobrenadante descartado e o pellet lavado com
etanol 70% e novamente centrifugado por 5 min. O sobrenadante foi novamente
descartado e o DNA precipitado foi seco à temperatura ambiente. O pellet foi
suspenso em formamida e aplicado no seqüenciador automático de DNA – ABI Prism 377 (Applied Biosystems – Carlsbad, California).
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3.1.4 Digestão do fragmento de DNA amplificado e do vetor pPIC9 com as enzimas de restrição XhoI e NotI
Os fragmentos de DNA amplificados e o vetor de expressão pPIC 9 (figura 4) foram inicialmente digeridos com enzima XhoI 20 U (Invitrogen – Carlsbad, California)
na presença de tampão React 2 (tris-HCl 0,5 M pH 8,0, contendo MgCl2 0,1 M e NaCl
0,5 M) em um volume final de 10 µL. A reação ocorreu a 37°C durante 16 h. Em seguida o fragmento de DNA que codifica para o AaTI e o vetor pPIC 9 foram precipitados com etanol absoluto como descrito anteriormente e foram digeridos com
a enzima NotI 10 U (Fermentas – Vilnius, Lituânia) na presença de tampão O (Tris-
HCl 50 mM pH 7,5 contendo MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM e albumina de soro bovino
(BSA) 0,1 mg/mL) em um volume final de 10 µL. A reação ocorreu a 37°C por 16 h. Após as digestões, o fragmento e o vetor digeridos foram aplicados no gel de agarose 1% e as bandas foram recortadas e extraídas do gel utilizando o kit QIAEX II (QIAGEN – Germany). O DNA foi então quantificado por leitura de absorbância em
260 nm, considerando a leitura de 1 de absorbância em 260 nm (A260) = 50 µg
Figura 4 – Vetor de expressão pPIC9. O fragmento de DNA que codifica para o AaTI foi
clonado entre os sítios de restrição XhoI e NotI.
3.1.5 Ligação do fragmento de DNA que codifica para o AaTI e para o AaTI∆ ao vetor de expressão pPIC9
Os fragmentos de DNA e o vetor de expressão pPIC9 digeridos com as
enzimas de restrição XhoI e NotI foram ligados na presença da enzima T4 ligase 1,5
U (Promega – Madison, USA) na presença de tampão tris-HCl 30 mM pH 7,8
contendo MgCl2 10 mM, DTT 10 mM e ATP 1 mM na proporção de 100:1
(fragmento:vetor). A reação foi incubada durante a noite a 16°C e, posteriormente, precipitada com etanol absoluto, como descrito anteriormente. O precipitado foi então dissolvido em 5 µL de água estéril.
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3.1.6 Preparo de bactérias E. coli cepa DH5-α competentes para eletroporação
Uma colônia de E. coli cepa DH5-α foi repassada em uma placa LB (Peptona
10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5 g/L) contendo ágar 15 g/L. Após o crescimento da colônia, foi feito um pré-inóculo de uma colônia isolada da placa em 3 mL de meio LB líquido foi incubado sob agitação de 180 rpm durante a noite a 37°C em agitador orbital Gallenkamp (Surrey, UK). Posteriormente o pré-inóculo foi adicionado em 300 mL de meio LB e a incubação prosseguiu até a leitura de
absorbância em 550 nm (A550) atingir o valor de0,5. Em seguida, as células foram
incubadas no gelo por 15 min e centrifugadas a 3225 g por 10 min a 4°C em
centrífuga Hitachi (Japão). O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 50 mL de água estéril gelada (4°C) e posteriormente foram adicionados mais 200 mL de água estéril gelada. As células foram centrifugadas
novamente a 3225 g por 10 min a 4°C. A etapa de lavagem foi repetida conforme
descrita anteriormente. Após a centrifugação, foram adicionados 40 mL de glicerol 10% estéril, e as células foram centrifugadas como descrito acima. O sobrenadante foi novamente descartado e as células foram ressuspensas em 1 a 2 mL de glicerol 10%. Foram preparados alíquotas de 50 µL que foram estocadas a -70°C.
3.1.7 Transformação de bactérias E. coli cepa DH5-α por eletroporação
As células eletrocompetentes foram retiradas do freezer -70°C e incubadas
durante 10 min em banho de gelo. Às células, foram adicionados 3 µL da ligação (AaTI + pPIC9) e a mistura transferida para a cubeta de eletroporação 0,2 cm (Bio- Rad – Hercules, CA) gelada. A eletroporação ocorreu utilizando os parâmetros: 2,5 kV, 200 Ohms, e 25 µF. Após a eletroporação foram adicionados 950 µL de meio
SOC: bacto triptona 2,0 %, extrato de levedura 0,5%, NaCl 100 mM, KCl 2,5 mM,
MgSO4.7H2O 10 mM, MgCl2 10 mM e glicose 20 mM (Sambrook et al., 1989) às
células. As células transformadas foram transferidas para tubos de 1,5 mL e mantidas a 37°C por 45 min sob agitação constante de 180 rpm. Após o tempo de incubação as células foram plaqueadas em meio LB-ágar contendo o antibiótico ampicilina 200 µg/mL e incubadas durante 15 h a 37°C.
3.1.8 Detecção de clones positivos por PCR e mini-preparação plasmidial
Cinco clones de bactéria contendo o fragmento do AaTI e oito do AaTI∆ foram
submetidos a uma PCR para verificar a presença do fragmento de DNA. Foram
utilizados os oligonucleotídeos AOX3’ e AOX5’, tampão para PCR, MgCl2 1,5 mM,
dNTP 0,2 mM e Taq polimerase 1 U. Três clones positivos foram selecionados para
extração de DNA plasmidial em pequena escala (Sambrook et al., 1989). Estes clones
foram inoculados em 3 mL de meio LB contendo ampicilina 200 µg/mL e incubados a 37°C por 16 h sob agitação constante de 180 rpm. A suspensão de bactérias foi
centrifugada a 15 700 g por 1 min à temperatura ambiente, o sobrenadante foi
descartado e as células suspensas em 100 µL da solução I (tampão tris-HCl 25 mM, pH 8,0 contendo EDTA 10 mM, glicose 50 mM e RNAse 100 µg/mL). Em seguida foram adicionados 200 µL da solução II (SDS 1%, NaOH 0,2 M) e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 5 min. Decorrido o tempo, foram adicionados 200 µL da solução III (acetato de potássio 3 M, ácido acético 5 M) e a mistura foi incubada no gelo por 30 min, sendo posteriormente centrifugada a 15 700
g por 5 min e o sobrenadante transferido para um tubo estéril, ao qual foi adicionado
30
novamente por 5 min, o pellet foi lavado com etanol 70% e após a última
centrifugação o DNA foi seco à temperatura ambiente e dissolvido em 30 µL de água estéril. O DNA purificado foi submetido a uma reação de seqüenciamento como descrita anteriormente, porém utilizando os oligonucleotídeos AOX 3’ ou AOX 5’ na concentração de 5 pmol/µL.
3.1.9 Midi preparação de DNA plasmidial
Um das colônias de cada construção positiva, cuja sequência de DNA se apresentava correta, foi inoculada em 200 mL de meio LB contendo ampicilina 200 µg/mL e incubada durante 18 h a 37°C. A midi preparação plasmidial foi realizada
utilizando o kit HiSpeed Plasmid Midi (QIAGEN – Germany) segundo as
especificações do fabricante. A quantificação de DNA foi feita por leitura de A260,
considerando 1 de A260 = 50 µg de DNA/mL de solução.