O termo “radicais livres do oxigênio” é geralmente utilizado de forma abrangente para designar todos os derivados reativos do oxigênio, incluindo aqueles que não são radicais, mas que tem alta propensão a formar radicais. Mais apropriadamente, estas substâncias altamente reativas recebem a designação de espécies reativas do oxigênio (EROs). Dentre as espécies reativas do oxigênio que não são radicais estão o peróxido de hidrogênio, por exemplo, que não possui elétrons não pareados e o oxigênio singleto (1O2). O ácido hipocloroso, produzido
pela enzima mieloperoxidase, também é um não radical, mas é um potente agente oxidante e, portanto, é considerado uma ERO (HALLIWELL, 1991).
O uso abrangente e genérico do termo ERO leva a uma noção incorreta de que todas estas espécies, abrigadas por este termo monolítico, têm ações e propriedades similares (MURPHY et al., 2011). As EROs devem ser consideradas particularmente e em relação ao
contexto biológico no qual estão inseridas (WINTERBOURN, 2008). Cada uma destas moléculas é uma entidade química distinta, com cinética, taxa e local de produção, difusão e sistemas de degradação peculiares. Assim, o impacto biológico de cada ERO depende criticamente da molécula em questão, do microambiente e do contexto, fisiológico ou não, onde ela é gerada. Agrupar todas as EROs como uma entidade única leva a hipóteses vagas e de difícil confirmação. Portanto, sempre que possível, as EROs consideradas como responsáveis pelo fenômeno em observação devem ser tomadas individualmente para estudo (MURPHY et al., 2011).
2.3.3 A síntese das EROs
Apesar das EROs poderem ser sintetizadas por várias enzimas citoplasmáticas, incluindo a xantina oxidase, a lipoxigenase, a cicloxigenase, a óxido nítrico sintase, além de provirem dos processos fisiológicos das mitocôndrias, a maioria das EROs deriva da enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase reduzida (NADPH oxidase), encontrada no interior dos fagócitos. Este complexo enzimático multi compartimental de transferência de elétrons, ligado à membrana celular do fagócito, sofre várias modificações em seus componentes intracelulares para tornar-se funcional durante a ativação leucocitária. A ativação da enzima NADPH oxidase é um processo complexo que consiste de várias etapas e é iniciado não só por bactérias, mas também por alguns produtos químicos. A consequência inevitável da ativação desta enzima, além da produção de energia para a célula, é a produção de subprodutos da respiração celular pelo escape eventual de elétrons, que são as EROs.
Os fagócitos podem ser induzidos a liberar EROs para os meios extra e intracelular através de sinais de ativação, acompanhados ou não de fagocitose. Os fatores desencadeadores da produção de EROs são uma combinação de eventos de ligações moleculares consequentes a processos infecciosos, enfermidades diversas, feridas e à introdução cirúrgica de material estranho no organismo. Esta forma de liberação de EROs pode se dar através da ativação de receptores específicos por proteínas do sistema complemento, que resultará em transdução de um sinal pró-inflamatório, culminando com a fagocitose, a ativação da NADPH oxidase e a degranulação dos neutrófilos. Os receptores de reconhecimento de padrões, presentes em fagócitos e várias células, também participam da
geração das EROs. Eles reconhecem e se ligam a uma série de biomoléculas altamente conservadas, os PAMPs ou os DAMPs. A estimulação dos PRRs resulta numa grande quantidade de eventos de transcrição intracelular, que levam à produção de citocinas, além de estimular a ativação e funcionamento da NADPH oxidase.
A liberação de citocinas não só incrementa a explosão respiratória pelos fagócitos, mas também tem a capacidade de modular esta explosão. Neste caso, as citocinas não incitam diretamente a produção de EROs, mas hipersensibilizam as células ao estímulo de um ligante bacteriano, resultando em uma resposta mais rápida e amplificada frente a um agente nocivo (BRYAN et al., 2012).
2.3.4 A NADPH oxidase
A NADPH oxidase é um complexo enzimático multi proteico, responsável pela transferência de elétrons da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) para o oxigênio molecular, resultando na formação do ânion superóxido. Para desempenhar esta função, é necessário que o complexo enzimático seja ativado. Na célula em repouso, as proteínas constituintes da NADPH oxidase encontram-se segregadas entre a membrana e o citosol (EL-BENNA et al., 2005; EL-BENNA; DANG; GOUGEROT-POCIDALO, 2008). Durante o processo de ativação da célula, oxidases citosólicas componentes da enzima, que são as proteínas oxidase-específicas, a saber: p40phox, p47phox, p67phox e uma GTPase (Rac1/2),
translocam para o fagossomo ou para a membrana plasmática, onde se unem em torno de um componente central, ligado à membrana, denominado flavocitocromo b558. O flavocitocromo
b558 é formado pelos componentes catalíticos p22phox e gp91phox. Este processo de acoplamento
e ativação é altamente regulado, envolvendo reações de fosforilação, translocação e múltiplas alterações de conformação da enzima (QUINN; GAUSS, 2004).
A NADPH oxidase está presente não somente em células fagocíticas, mas também em uma variedade de outros tipos celulares, e estruturalmente estes complexos enzimáticos são bastante similares, apesar de se prestarem a diferentes funções. As EROs geradas pelas NADPH oxidases de células não fagocíticas parecem estar primariamente envolvidas com a sinalização intra e intercelular, mais do que com os mecanismos de defesa do hospedeiro (QUINN; GAUSS, 2004; BRYAN et al., 2012). Ainda, as NADPH oxidases de células não
fagocíticas produzem o radical superóxido na fração de 1 a 10% dos níveis produzidos pelos neutrófilos (VALKO et al., 2007).
Uma série de inibidores da NADPH oxidase foi descrita, e moléculas biológicas estão entre eles. São exemplos o óxido nítrico (NO) (CLANCY; LESZCZYNSKA-PIZIAK; ABRAMSON, 1992), os esteroides (LAUFS et al., 2003), a adrenalina (O’DOWD et al., 2004), a interleucina-10 (IL-10) (ELBIM et al., 2001) e a interleucina 4 (IL-4) (ZHOU; LIN; MURTAUGH, 1995).
2.3.5 O Radical Superóxido (O2-)
As fontes mais importantes de O2-, in vivo, são a cadeia de transporte de elétrons da
mitocôndria, o retículo endoplasmático e os cloroplastos (HALLIWELL, 1989). O principal vazamento de elétrons na mitocôndria ocorre através do complexo NADH-ubiquinona redutase, um dos quatro complexos enzimáticos da cadeia respiratória, e através da forma reduzida da ubiquinona (TURRENS, 1982).
O sistema mais eficiente de produção de radical superóxido é a enzima NADPH oxidase, que se encontra ligada a membrana de células fagocíticas ativas (CURNUTTE; BABIOR, 1987), e é de grande importância para as células animais. Com o início da fagocitose, estas células exibem um dramático aumento do consumo de oxigênio, conhecido como explosão respiratória (ou burst respiratório), processo que em nada se relaciona com a respiração mitocondrial. Outro sistema capaz de gerar radical superóxido em cadeias de transporte de elétrons é a cadeia que utiliza NADH ou NADPH da membrana nuclear, cuja função é ainda desconhecida. Uma vez que os radicais são gerados nas proximidades do DNA celular, especula-se que este sistema possa ter um especial significado, in vivo (HALLIWELL, 1991).
O outro processo capaz de gerar o radical superóxido é a reação auto-oxidativa da célula. Na presença de oxigênio muitas substâncias - como por exemplo, o gliceraldeido, os nucleotídeos de flavina reduzidos, a adrenalina e os compostos tióis, tais como a cisteína- sofrem oxidações espontâneas. Uma importante reação auto-oxidativa ocorre com a hemoglobina carreando oxigênio, a oxihemoglobina, que é oxidada a sua forma inativa, a
metemoglobina, com concomitante liberação de radical superóxido. A metemoglobina contém ferro no núcleo heme, na forma de Fe3+, e é incapaz de se ligar ao oxigênio (HALLIWELL,
1989).
A reatividade dos radicais superóxido depende largamente da natureza do meio onde se encontram. Eles são altamente reativos e estáveis em meio hidrofóbico, enquanto em meio hidrofílico têm baixa reatividade e desaparecem rapidamente (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1986). Em solventes orgânicos, o radical superóxido é uma base forte e nucleofílica, enquanto em solução aquosa possui propriedades redutoras e ao mesmo tempo fracamente oxidantes, caracterizando reações redox denominadas de desproporcionação. Nas reações de desproporcionação uma substância é, ao mesmo tempo, oxidada e reduzida, dando origem a dois produtos diferentes. Em relação ao radical superóxido, estas reações são mais rápidas em pH ácido e geram H2O2. Dadas as suas propriedades redutoras, o radical
superóxido pode reduzir, por exemplo, o citocromo da cadeia respiratória mitocondrial (MCCORD; CRAPO; FRIDOVICH, 1977). Suas propriedades fracamente oxidantes o tornam capaz de oxidar catecolaminas, tocoferol, ascorbato, a NADH ligada ao lactato e vários tióis. O ferro também pode ser oxidado ou reduzido pelos radicais superóxido.
Apesar do O2- ter reatividade limitada em solução aquosa, sua rápida e eficiente
eliminação é de grande importância para a célula, uma vez que ele pode dar origem a EROs mais deletérias. A eliminação do radical peróxido da célula é realizada pela enzima superóxido dismutase (SOD).