Os avanços nas novas tecnologias de sequenciamento (NGS - Next-Generation Sequencing) impulsionaram o desenvolvimento de uma nova abordagem de genotipagem em larga escala denominada genericamente de genotipagem-por-sequenciamento (GbS-Genotyping-by-
Sequencing) (Elshire, Glaubitz et al., 2011). Essa abordagem apresenta potencial de
genotipar milhares de amostras para milhares ou dezenas de milhares de marcadores a custos accessíveis.
A empresa DArT Pty Ldt têm adotado as novas tecnologias de sequenciamento para a geração de marcadores GbS, na qual baseia-se na redução de complexidade genômica da amostra de DNA total utilizando combinações específicas de enzimas de restrição, ligação de adpatadores e amplificação por PCR com adaptadores, similar à empregada na tecnologia DArT. Os fragmentos selecionados resultantes da redução de complexidade são submetidos ao sequenciamento para a geração de dezenas de milhões de sequências curtas (em geral de 75 bases) em plataformas de sequenciamento NGS. Cada amostra de DNA a ser genotipada recebe adaptadores com sequências indexadoras (barcodes) que permitem mais tarde rastrear as sequências geradas para cada amostra. Desta forma, 96 amostras podem ser sequenciadas conjuntamente, otimizando significativamente os custos. O polimorfismo entre os diferentes indivíduos são detectados (1) pela presença ou ausência das sequências (2) ou pela busca de polimorfismos de base individual (SNPs) entre sequências homólogas presentes nos indivíduos. Esta nova abordagem permite genotipar milhares de amostras para milhares ou dezenas de milhares de marcadores a custos competitivos com outras plataformas de genotipagem (Poland, Brown et al., 2012; Sansaloni, 2012).
Recentemente foram publicados trabalhos mostrando o sucesso da técnica para espécies com genoma complexo como milho, trigo e cevada (Elshire, Glaubitz et al., 2011; Poland, Brown et al., 2012; Beissinger, Hirsch et al., 2013), e espécies como soja (Sonah, Bastien et
al., 2013), Panicum (Lu, Lipka et al., 2013), framboesa (Ward, Bhangoo et al., 2013) entre
outros. Na área florestal a metodologia foi aplicada em Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al., 2011) pelo laboratório DArT Pty Ltda. Até então nenhum trabalho em coníferas foi publicado
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utilizando está metodologia, sendo este trabalho o primeiro a utilizar a tecnologia GbS para a espécie Pinus taeda.
OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
1) Desenvolver de um microarranjo de genotipagem de marcadores DArT para o gênero
Pinus e a demonstração de sua aplicação em um estudo filogenético de espécies de Pinus (Capítulo 2);
2) Construir de um mapa genético de alta densidade a partir de gametas haploides de uma árvore única de Pinus taeda utilizando a tecnologia de genotipagem por sequenciamento DArT-Seq, marcadores microssatélites e demonstração da utilidade do mapa para a ancoragem de clones BAC de Pinus taeda (Capítulo 3).
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CAPÍTULO 2 - DESENVOLVIMENTO DE UM MICROARRANJO DE GENOTIPAGEM
DE MARCADORES DArT E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE ESPÉCIES AMERICANAS
DE Pinus
2.1 INTRODUÇÃO
Pinus taeda é uma das espécies florestais mais importantes entre as espécies florestais
plantadas comercialmente nos Estados Unidos e no Brasil, com grande valor econômico e grande importância ecológica. A disponibilidade de marcadores moleculares para o melhoramento dessa espécie é de fundamental importância. Marcadores moleculares como RFLPs, AFLPs, RAPDs, ESTPs, SSRs e SNPs já foram extensivamente utilizados em P. taeda (Devey, Fiddler et al., 1994; Remington, Whetten et al., 1999; Sewell, Sherman et al., 1999; Elsik, Minihan et al., 2000; Temesgen, Brown et al., 2001; Eckert, Pande et al., 2009).
Apesar da ampla utilização dos marcadores moleculares em Pinus taeda, para aumentar a resolução e a velocidade das aplicações genéticas no melhoramento de Pinus e realizar uma análise genômica de alto desempenho, marcadores informativos e extremamente polimórficos com ampla cobertura do genoma são necessários. Para isso, métodos de genotipagem em larga escala a baixos custos são fundamentais. Uma grande limitação para que isso ocorra é o genoma complexo e extenso de P. taeda (24 Gb por conteúdo haploide), rico em sequências de DNA altamente repetitivas e extensas famílias gênicas (Kinlaw e Neale, 1997; Grotkopp, Rejmanek et al., 2004; Kovach, Wegrzyn et al., 2010). A maioria dos marcadores moleculares desenvolvidos para P. taeda demandam tempo, são laboriosos e apresentam altos custos quando há a necessidade de uma elevada densidade de genotipagem.
A metodologia Diversity Array Technology (DArT) (Jaccoud, Peng et al., 2001) proporciona uma aplicação bem sucedida da plataforma de microarranjo para a análise de polimorfismos de DNA. A tecnologia DArT fornece uma alternativa promissora para satisfazer os requisitos de genotipagem de alto rendimento e ampla cobertura do genoma de Pinus, permitindo analisar milhares de marcadores genéticos com relativa facilidade e em pouco tempo.
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Diversity Array Technology é um método de identificação de polimorfismo de DNA no qual a
análise de marcadores genéticos em microarranjos oferece um sistema rápido, robusto, de baixo custo e alto desempenho, requerendo uma quantidade mínima de amostra, com a capacidade de criar um perfil do genoma inteiro de um organismo ou populações de organismos sem necessidade de informação prévia sobre a sequência do DNA (Jaccoud, Peng et al., 2001; Wenzl, Carling et al., 2004; Sansaloni, Petroli et al., 2010). Este método permite identificar paralelamente centenas a milhares de locos genômicos e os polimorfismos presentes nos mesmos. DArT fornece marcadores de alta qualidade e possui potenciais aplicações para ser utilizado em caracterização de germoplasma, estudo de diversidade genética e melhoramento assistido por marcadores. Além disso, pode ser empregado na identificação de QTLs e criação de mapas genéticos de alta densidade.
Marcadores DArT com alta qualidade foram desenvolvidos com sucesso para várias espécies, como plantas, animais, fungos e microorganismos (Jaccoud, Peng et al., 2001; Wenzl, Carling
et al., 2004; Braithwaite, 2005; Wittenberg, Van Der Lee et al., 2005; Xia, Peng et al., 2005;
Amorim, Vilarinhos et al., 2009; Bartos, Sandve et al., 2011; Howard, Whittock et al., 2011; Yang, Saxena et al., 2011). Marcadores DArT foram desenvolvidos também para espécies com genomas extensos e complexos como a cana-de-açúcar (poliploide com ~10Gpb por conteúdo haploide) (Heller-Uszynska, Uszynski et al., 2011), trigo (Akbari, Wenzl et al., 2006; Peleg, Saranga et al., 2008), centeio (Bolibok-Bragoszewska, Heller-Uszynska et al., 2009), o hexaploide triticale (AABBRR - híbrido de trigo e centeio) (Badea, Eudes et al., 2011) e a cevada (Wenzl, Carling et al., 2004; Zhang, Marchand et al., 2009). Na área florestal foram desenvolvidos marcadores DArT para espécies de Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al., 2010). Até o momento nenhuma conífera foi genotipada utilizando essa tecnologia.
Nesse capítulo é apresentado o desenvolvimento do primeiro microarranjo de genotipagem de marcadores DArT para o gênero Pinus, em particular para a espécie Pinus taeda, e a demonstração de sua aplicação em estudo de diversidade interespecífica entre algumas das principais espécies do gênero Pinus plantadas no Brasil. Para isso, a seleção de um material genético informativo e rico em diversidade genética foi necessária, além de uma boa redução de complexidade genômica proporcionando uma ampla representação genômica.
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