Imperfect Self-Awareness

Sandra Regina de Carvalho Marchesin1 e Eliana Morielle Versute2

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,

1

Departamento de Biologia, São José do Rio Preto, SP, Brasil 2

Departamento de Zoologia e Botânica, São José do Rio Preto, SP, Brasil

Palavras Chaves: variabilidade genética, enzimas de restrição, similaridade

genética, biodiversidade

Key words: genetic variability, restriction enzymes, genetic similarity,

biodiversity

Resum o

A análise do padrão de restrição pela técnica PCR-RFLP em seqüências gênicas nuclear (RAG2) e mitocondrial (12/16S) de 23 espécies de morcegos das famílias Molossidae, Phyllostomidae, Vespertilionidae e Emballonuridae gerou um número grande de fragmentos, sendo 107 para o gene RAG2 e 155 para o 12/16S,

combinados em 139 e 402 haplótipos, respectivamente. Os valores de variação gênica detectados foram baixos para as duas seqüências (0,13, RAG2 e 0,15, 12/16S) refletindo o conservacionismo dessas, reforçado pelos valores altos de Identidade Genética inter e intra-específica (74 – 100%). As espécies com maior variação gênica foram variáveis nas análises do RAG2 (Eumops perotis, Artibeus

lituratus, Carollia perspicillata e Molossus rufus) e 12/16S (Nyctinomops laticaudatus e Carollia perspicillata), contudo, uma delas C. perspicillata foi a

que apresentou também a maior variação intra-específica. No conjunto de espécies e gêneros das famílias, Molossidae foi a que mais variou, em conseqüência da variação apresentada especialmente pelas espécies de Eumops e Nyctinomops.

Abst ract

The analysis of the restriction pattern by the PCR-RFLP technique in nuclear (RAG2) and mitochondrial (12/16S) gene sequences of 23 bat species from Molossidae, Phyllostomidae, Vespertilionidae and Emballonuridae families generated a large number of fragments: 107 for RAG2 and 155 for 12/16S combined, respectively, in 139 and 402 haplotypes. The values detected for gene variation were low for both sequences (0,13 for RAG2 and 0,15 for 12/16S) and reflected their conservative feature, reinforced by high values of inter and intra- species Genetic Identity (74-100%). The species with a high gene divergence were variable in the analyses of RAG2 (Eumops perotis, Artibeus lituratus,

Carollia perspicillata and Molossus rufus), although one of them C. perspicillata

of the families, Molossidae had the highest variation due to the variation in

Eumops and Nyctinomops species.

I nt rodução

Os morcegos constituem a segunda maior ordem de mamíferos, contando hoje com aproximadamente 1000 espécies amplamente distribuídas, ocorrendo em regiões tropicais e temperadas, com exceção de algumas ilhas oceânicas remotas e Antártica (Koopman, 1970; Nowak, 1999).

Apesar desta importante irradiação, os relacionamentos evolutivos da ordem são pouco conhecidos e os resultados controversos (Koopman, 1970; Nowak,1999; Simmons, 1998, 2000; Jones et al., 2002). Em conseqüência, muitos estudos comparativos buscando identificar os padrões evolutivos dentro da ordem vêm sendo desenvolvidos, deixando evidente a importância de uma avaliação da história evolutiva dos clados através de análises comparativas consistentes e bem documentadas.

A origem monofilética de Chiroptera tem sido apoiada por estudos bioquímicos, moleculares e morfológicos (Simmons, 1998; Simmons & Geisler, 1998; Van Den Bussche et al., 1998; Nikaido et al., 2000; 2001; Teeling et al., 2000, 2002) e, ao nível infra ordinal, há um consenso relativo quanto aos relacionamentos entre as 17 famílias reconhecidas de Microchiroptera, este derivado das várias propostas que têm sido apresentadas baseadas em diferentes conjuntos de dados (Smith, 1976; Van Valen, 1979; Novacek, 1980; Pierson, 1986; Teeling et al., 2000, 2005). Apesar disso, a sistemática do grupo é bastante complexa, e relacionamentos

filogenéticos não muito bem estabelecidos aparecem em várias famílias e gêneros (Simmons & Geisler, 1998; Jones et al., 2002).

Estudos populacionais intra e interespecíficos têm sido amplamente utilizados na determinação dos processos e padrões macro-evolutivos apresentados pelas filogenias de diferentes espécies, a fim de fundamentar, entre outras, as análises dos padrões morfológicos utilizados na maioria das filogenias. A maior parte deles têm procurado determinar, a partir da detecção da variação e/ou origem de novos alelos, o “comportamento” dos genes no nível intra e interespecífico e seu papel na evolução (Hillis et al., 1996; Avise 2000; Juste et al., 2004).

O conhecimento da variação e comportamento de caracteres moleculares variáveis, ou seja, dos marcadores genéticos, para uma espécie em particular, permite estimar a história evolutiva da espécie, como o tamanho da população, origem, estrutura de acasalamento e estabelecimento do relógio biológico (molecular), tendo ainda, um papel significativo em estudos de populações de diversos organismos e na sua biogeografia.

Pierson (1986) foi o primeiro pesquisador a examinar os caracteres moleculares para estudo de relacionamento entre famílias de Microchiroptera. Desde esta data, inúmeros estudos filogenéticos têm se baseado na análise de dados moleculares, como ferramenta auxiliar na sistemática dos grupos de morcegos. Por isso, no presente estudo, 23 espécies pertencentes às famílias Molossidae, Phyllostomidae, Vespertilionidae e Emballonuridae foram investigadas, utilizando- se análises de PCR-RFLP de segmentos gênicos nuclear e mitocondrial, com intuito

de avaliar a estrutura e comportamento genético das seqüências nos indivíduos destas complexas famílias de morcegos.

M at erial e m ét odos

Táxons examinados

Foram analisados 88 espécimes representantes de 13 gêneros e 23 espécies das famílias Molossidae (11), Phyllostomidae (4), Vespertilionidae (6) e Emballonuridae (2), provenientes do Estado de São Paulo, Mato Grosso-MT e Mato Grosso do Sul-MS. Destas, 18 espécies representantes de 11 gêneros foram utilizadas nas análises do gene nuclear RAG2, e 23 espécies representantes de 13 gêneros nas análises do gene mitocondrial 12/16S (Apêndice I).

O número de espécimes analisados de cada táxon foi variável, em decorrência do número de amostras de tecidos colecionados disponível no laboratório de Chiroptera, e do número de captura de espécimes e obtenção de amostras de alguns táxons.

Extração de DNA genômico e amplificações

O DNA genômico foi extraído de fragmentos de fígado, rim, pulmão e músculo frescos ou congelados à –20oC, segundo protocolo de Sambrook et al. (1989), sem a utilização do fenol.

Após precipitação pela adição de etanol absoluto gelado, o DNA obtido foi recolhido, diluído em tampão TE (10 mM Tris/1 mM EDTA), e a qualidade e

quantidade avaliada e estimada em espectofotômetro de acordo com Werman et

al. (1999).

As amplificações por reação em cadeia de polimerase (PCR) foram conduzidas segundo o protocolo descrito por Lewis-Oritt et al. (2001) para o gene RAG2, com a utilização dos primers: RAG2 R1 - 5’ GGC TGG CCC AA(AG) AGA TCC TG 3’ e RAG2 F1 - 5’ G(AG)A AGG ATT TCT TGG CAG GAG T 3’, e por Morales et al. (1993) para o gene 12/16S, com a utilização dos primers: Primer1 - 5’ TGG GAT TAG ATA CCC CAC TAT 3’ e Primer2 - 5’ TGA TTA TGC TAC CTT TGC ACG GT 3’. Todas as reações foram realizadas em termociclador Perkin Elmer – Gene Amp PCR System.

Os produtos amplificados nas reações de PCR foram aplicados em gel de agarose 1,5% solubilizado em tampão TAE 1X e corado com brometo de etídio para visualização em luz ultra violeta. O tamanho dos produtos obtidos nas reações, foi estimado com o marcador de peso molecular ladder de 100pb (BioLabs e AMRESCO).

Análise molecular

Para a determinação do padrão de variação das seqüências e haplótipos, essas foram submetidas à digestão completa dupla (associação de duas enzimas) e simples (uma única enzima). Foram utilizadas dez enzimas de restrição: HaeIII, HindIII,

PstI, XhoI, DraI, ScaI, DdeI, BglII, EcoRI, RsaI. Cada 6µl do amplificado foi

digerido com três unidades de enzima, conforme as especificações dos fabricantes. As digestões duplas foram realizadas observando-se a compatibilidade dos tampões

envolvidos nas reações onde, oito enzimas (exceto RsaI) foram associadas à enzima

EcoRI. Para a enzima RsaI cujo tampão não foi compatível, o procedimento adotado

foi o de digestão simples, também utilizado para a enzima EcoRI, como controle nas digestões duplas. Após as digestões, os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e visualizados em luz ultra violeta, onde as imagens foram fotografadas utilizando-se máquina Polaroid. Os fragmentos foram identificados por tamanho em pares de bases (pb) e pela enzima que os gerou.

Análise estatística e genealógica

Para as análises genéticas foram construídas duas matrizes, de presença (1) e ausência (0) dos fragmentos obtidos a partir das digestões. Os dados foram submetidos à análises de distância pelos programas PopGene 1.31 (Yeh et al., 1999) pelo algoritmo Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Means (UPGMA) (Seneath & Sokal, 1973), baseados no modelo matemático Nei (1978), que considera o índice de identidade entre as populações e análises estatísticas relativas à freqüência de polimorfismos, diversidade gênica e genética dos espécimes estudados.

Para detecção da variação gênica e identidade genética foram especulados os seguintes parâmetros:

- valores médios da variação gênica detectada pelas 10 enzimas na amostra de 88 espécimes para o gene 12S/16S, e na amostra de 43 espécimes para o gene RAG2;

- índice de diversidade (variação gênica = h) dos genes RAG2 e 12S/16S para espécies com três ou mais espécimes analisados;

- freqüência de loci polimórfico;

- valores médios da identidade genética (I) dos indivíduos das espécies nas quais foram analisados pelo menos três espécimes;

- valores médios da identidade genética de 18 espécies para o gene RAG2, e de 23 espécies para o gene 12S/16S, independente do número de espécimes.

Result ados

Para a obtenção do padrão de digestão simples e dupla das seqüências RAG2 e 12/16S, foram utilizados no mínimo um (no caso dos espécimes raros e difíceis de coletar) e no máximo cinco espécimes, representantes das 18 espécies utilizadas para o gene RAG2, e no mínimo um e no máximo sete espécimes, representantes das 23 espécies utilizadas para o gene 12/16S, num total de 43 e 87 respectivamente.

Padrão das digestões simples e duplas da seqüência dos genes RAG2 e 12/16S A análise das digestões mostrou que os fragmentos produzidos apresentaram diferentes tamanhos (pb) e variação na intensidade das bandas.

Na Figura 1 é possível observar o padrão de cortes nos segmentos gênicos RAG2 e 12/16S de espécime da espécie Artibeus lituratus, após as digestões duplas e simples. Ela evidencia que nessa, assim como em outras espécies, o

padrão de corte nos dois segmentos foi diferente, sendo que o gene RAG2 (Figura 1A) é o que apresentou um menor número de fragmentos quando comparado aos obtidos para o gene 12/16S (Figura 1B). É possível observar também, as diferenças na intensidade das bandas produzidas até mesmo naquelas de igual tamanho (peso molecular).

Ao analisarmos as bandas produzidas para o mesmo segmento gênico em espécimes da mesma espécie, o padrão de corte observado foi o mesmo na maioria dos indivíduos. Quando foram comparados os padrões em indivíduos de espécies diferentes, foi observado, como esperado, uma variação no tamanho dos fragmentos (pares de base) evidenciando diferenças na posição e/ou número de sítios de cortes das enzimas. Contudo, em espécimes de espécies congêneres o padrão de corte foi muito semelhante, conforme pode ser evidenciado na Figura 2 para o segmento gênico 12/16S de E. perotis e E. glaucinus da família Molossidae.

O registro dos fragmentos produzidos em cada espécime, identificados pelos seus tamanhos em pb e pela enzima que os gerou, reuniu um total de 107 fragmentos diferentes para o gene RAG2 e 155 fragmentos para o gene 12S/16S (Tabelas 1 e 2).

Nota-se pelas Tabelas que o número de cortes e fragmentos, assim como o número de haplótipos detectados foi diferente para cada enzima, assim como no segmento gênico.

A enzima que produziu o maior número de fragmentos e detectou o maior número de haplótipos (28) no gene RAG2 foi a RsaI, que foi utilizada apenas nas

digestões simples. Para este gene o número de fragmentos produzidos no conjunto das digestões foi 107, combinados em 139 haplótipos.

No segmento gênico 12/16S foram produzidos, no conjunto de enzimas, 155 fragmentos, sendo o maior número deles produzido pela enzima ScaI (ScaI+EcoRI). Da mesma forma que para o gene anterior, a enzima que detectou o maior número de haplótipos, 59 do total de 402, foi a RsaI, seguida pela DdeI.

O registro da presença ou ausência dos fragmentos na matriz binária avaliada pelo programa Popgene, mostrou como estão variando os haplótipos dentro e entre as espécies.

O índice de diversidade gênica da população, detectada pelas 10 enzimas, para o gene nuclear foi h= 0,13 e para o gene mitocondrial, foi h=0,15, índices considerados baixos, refletindo o conservacionismo no padrão geral das digestões.

Nas Tabelas 3 e 4 é possível observar os valores da variação gênica, da freqüência de loci polimórficos e identidade genética exibidos por oito espécies para as quais foram analisados com três ou mais espécimes no gene RAG2 (Tabela 3), e 16 espécies no gene 12/16S (Tabela 4).

Os índices obtidos para o conjunto de dados a partir do gene nuclear (0,13) foram pouco menores que os observados para os genes mitocondriais (0,15). Contudo, se consideradas as espécies individuais, os valores da variação gênica e freqüência de loci polomórficos foram variáveis entre as espécies, para o mesmo gene, e na espécie, nos dois diferentes genes.

O maior índice de diversidade gênica e freqüência de polimorfismos no gene RAG2 foi exibido por E. perotis (28%), seguido de A. lituratus e C.

perspicillata que apresentam a mesma freqüência de loci polimórficos (26%). O

menor índice de diversidade e freqüência de polimorfismos observados foi em M.

rufus (h=0,06 e 17%). Já para o gene 12/16S, a espécie com maior diversidade e

polimorfismos foi N. laticaudatus (44%), seguida de C. perspicillata (21%), enquanto que a com menor variação foi E. furinalis (14%) seguida de P. discolor (15%).

Os valores médios de Identidade genética observados entre indivíduos da mesma espécie foram relativamente altos, variando de 74% (E. perotis e C.

perspicillata) a 100% (N. laticaudatus) no gene RAG2, e 70% (N. laticaudatus) a

100% (N. macrotis) no gene 12/16S e, à semelhança dos demais índices, variaram para as espécies nos diferentes genes. A maior variação na identidade foi exibida por N. laticaudatus para o gene 12/16S e C. perspicillata para o gene RAG2. Em

N. laticaudatus os valores ficaram entre 97% a 70% e em C. perspicillata 97 a

74%. A menor variação foi exibida pela espécie E. auripendulus, seguida de A.

lituratus e M. rufus, com valores entre 85 – 84%, 84 – 80% e 95 – 90%,

respectivamente.

Os resultados dos índices calculados evidenciam também, que para os genes analisados, os valores não foram influenciados pela diferença na procedência dos animais, indicando similaridade entre os indivíduos. As diferenças entre os maiores e menores valores de identidade genética à exemplo de N. macrotis (100 - 82%), onde todos indivíduos foram coletados em Campo Grande-MS, N. laticaudatus (97 – 70%), onde todos espécimes foram coletados em São José do Rio Preto-SP, M. temminckii (97% – 88%), cujos indivíduos

procedem de várias localidades como, São José do Rio Preto-SP, Mirassol-SP, Olímpia-SP e Campo Grande-MS, e E. glaucinus (96 – 82%), com representantes de São José do Rio Preto-SP, Nova Aliança-SP e Nova Granada-SP, não diferiram acentuadamente.

No conjunto dos gêneros que formam as diferentes famílias e consideradas todas as espécies, independente do número de indivíduos, a família Molossidae foi a que apresentou maior variabilidade quando comparada com as outras famílias estudadas, onde o índice de identidade entre as espécies variou de (I): 84 a 100% (RAG2) e 79 a 99% (12/16S), enquanto que a mais conservada foi a família Phyllostomidae, cujos índices variaram de (I): 95 a 99% no RAG2 e 97 a 99% (12/16S) (Tabela 5 e 6). No conjunto de dados comparando as famílias duas a duas, Molossidae e Vespertilionidae foram as mais diversas com valores de identidade variando de (I): 76 a 97% e as com menor variação foram Phyllostomidae e Emballonuridae com (I): 90 a 95% (gene RAG2).

Discussão

O desenvolvimento de técnicas para o estudo do DNA propiciou um enorme avanço para o conhecimento da evolução e genética de vários grupos animais. A variabilidade detectada nas diferentes análises reflete as variações nas seqüências de DNA, as quais são a base da diversidade dentro de uma espécie.

Embora o seqüenciamento direto de DNA nos últimos anos esteja entre as técnicas mais amplamente utilizadas na detecção de polimorfismos, os estudos de

RFLP são úteis na detecção de polimorfismos para um grande número de indivíduos, o que muitas vezes é proibitivo para o seqüenciamento.

No presente estudo o número de haplótipos detectados pela análise RFLP foi significativo, ou seja 139 para o gene RAG2 e 402 para o gene 12/16S, o que foi representativo quando considera-se o tamanho das seqüências (aproximadamente 1400/1500 pb) e o número de indivíduos analisados em cada seqüência, evidenciando a eficiência das enzimas utilizadas nas análises e, portanto, sua importância.

A enzima RsaI destacou-se pois ela foi a que mostrou-se mais eficiente na detecção de polimorfismos nos dois segmentos gênicos, mesmo tendo sido utilizada somente nas digestões simples. A eficiência das diferentes enzimas está diretamente relacionada à estrutura molecular do segmento gênico envolvido, e a presença nele do sítio de corte de reconhecimento da enzima.

O DNA mitocondrial gerou um maior número de fragmentos e maior número de haplótipos, quando comparados com os obtidos para o segmento nuclear RAG2. Possivelmente em conseqüência, não exclusivamente, mas predominantemente, do maior número de indivíduos analisados para este gene. Ao avaliarmos a quantidade de variabilidade detectada para os dois genes, os valores foram muito próximos (h=0,13 – RAG2 e h=0,15 – 12/16S), indicativos de que ambos representam marcadores interessantes na avaliação da variabilidade genética em espécies de morcegos.

Além da variação nos fragmentos e haplótipos, foi observado também variação na intensidade das bandas, provavelmente devida ao número de

fragmentos de mesmo tamanho, homólogos ou não, e a digestão incompleta do fragmento original (1400/1500 pb). O conservacionismo no padrão de corte em espécies congêneres, evidente até mesmo na imagem dos géis, evidenciou uma similaridade molecular nas seqüências.

Os valores de identidade genética (I) obtidos para os genes RAG2 e 12S/16S foram, para a maioria das espécies, altos entre indivíduos da mesma espécie, indicando que os haplótipos produzidos pelas diferentes enzimas são conservados, apresentando pouca variação. O mesmo pôde ser observado na análise da variação gênica das várias espécies, quando foram considerados os 107 fragmentos produzidos para o segmento gênico RAG2 e os 155 fragmentos produzidos para o segmento gênico 12S/16S, onde os índices de variação não foram superiores a 0,12, para o gene RAG2 (E. perotis, A. lituratus e C.

planirostris) e 0,16 o gene 12/16S (N. laticaudatus).

Apesar de baixos, os valores de variação gênica e polimorfismos foram diferentes entre as várias espécies. As espécies mais polimórficas e com maior variação gênica para o gene RAG2 foram E. perotis, A. lituratus e C.

perspicillata, enquanto que para o gene 12/16S, as mais polimórficas não foram

necessariamente as que apresentaram maior variação gênica. Nyctinomops

laticaudatus foi a espécie mais polimórfica e com maior variação, contudo, a

segunda mais polimórfica, M. nigricans apresentou o terceiro maior valor de variação gênica.

Ainda com relação aos valores de Identidade genética dentro das espécies e considerando o gene RAG2, a espécie C. perspicillata foi a que mais variou,

com índices de identidade entre 74 – 97%, seguida de E. perotis com os índices de identidade entre 74 – 90%. Estes resultados apontam para ocorrência de variações intra-específicas, que não se comportam da mesma maneira nas diferentes espécies de morcegos. Aparentemente as variações não estão relacionadas com a procedência dos espécimes, visto que cinco dos seis espécimes de C. perspicillata utilizados nesta análise, foram coletados numa mesma colônia, em São José do Rio Preto, diferentemente de E. perotis cujos espécimes foram coletados em diferentes colônias, localizadas em diferentes municípios pertencentes a região de São José do Rio Peto.

Para o gene 12/16S, N. laticaudatus foi a espécie que apresentou maior variação na identidade genética entre os espécimes, com valores entre 70 – 97%, seguida de M. nigricans e M. molossus, cujos valores de identidade genética foram entre 74 – 95% e 75 – 95%, respectivamente. À semelhança da situação anterior, as variações não devem ser devidas à diferenças na procedência dos espécimes, e a princípio estão sendo interpretadas como conseqüentes da variação natural da amostra, onde um espécime muito diferenciado geneticamente poderia alterar significantemente os valores de distância.

Os espécimes de A. lituratus foram os mais distantes geneticamente para o gene RAG2 (ID = 80-84%) e os de E. auripendulus (ID = 84-85%) e C.

perspicillata (ID = 74 – 88%) para o gene 12/16S.

O conservacionismo nos segmentos gênicos avaliados, observado nos baixos índices de variação gênica e distância apresentada pelas espécies do presente trabalho, também já foi relatado pela literatura em estudos de outra

natureza, como citogenéticos (Patton & Baker, 1978; Morielle-Versute et al., 1996; Leite-Silva et al., 2003), morfológicos (Eger, 1977; Freeman, 1981) e moleculares (Ditchfield, 2000; Rivers, et al., 2005). As variações encontradas apesar de pequenas, podem ser indicativas da variabilidade natural, dentro das espécies e gêneros analisados.

Os resultados obtidos no presente estudo evidenciam a existência de um padrão conservado bastante significativo das seqüências gênicas analisadas nas diferentes espécies e famílias de morcegos. Esse conservacionismo também foi apontado por Ditchfield (2000) que comparou os padrões filogeográficos de espécies de morcegos da família Phyllostomidae (Artibeus lituratus, Carollia

perspicillata, Sturnira lilium e Glossophaga soricina) com pequenos mamíferos

não voadores. Neste estudo, os dados revelaram que a variação genética encontrada em morcegos é 10 vezes menor que em outros pequenos mamíferos, quando comparados a variação geográfica.

A maior variabilidade apresentada pela família Molossidae quando consideradas as espécies e gêneros independentemente do número de espécimes avaliados, e para as duas seqüências gênicas, é devida à variação que caracteriza alguns gêneros e espécies, especialmente de Eumops e Nyctinomops.

O gênero Eumops é apontado por Freeman (1981) como um grupo morfologicamente distinto. Contudo, a autora propõe a monofilia do gênero baseada em traços derivados e similaridades na forma do crânio. Esta variabilidade é apontada também por outros autores, como Eger (1977) onde a

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