Transfusão de sangue (S, N) Episódio de rejeição aguda Infecções virais (S,N)
Tempo sem o uso de medicamento a
Os grupos de estudo em tratamento com imunossupressores (ST, indivíduos com função estável do enxerto; CR, indivíduos com rejeição crônica) e os grupos que não estão sob tratamento de imunossupressores (OT, indivíduos tolerantes operacionais; HE, voluntários saudáveis); m, mascu
sim/não. Os dados numéricos são dados como média ± desvio padrão (SD). Para mais detalhes sobre os dados clínicos dos sujeitos da pesquisa veja A
Como critério de função renal “normal” foi adotado o limi
creatinina >45 ml/min, não apresentando variação negativa de clearance maior do que 10% nos últimos 6 meses ou níveis considerados dentro da normalidade de creatinina sérica nos últimos 6 meses.
No grupo CR, os indivíduos com rejeição crônica tiveram o seu diagnóstico confirmado por biópsia renal que foi analisada de acordo com a classificação histopatológica do rim transplantado
pesquisa estão disponíveis no anexo III, assim como o documento de aprovação do projeto pelo comitê de ética (Anexo II).
HE, os saudáveis, são doadores de pacientes transplantados Os critérios de seleção do grupo HE foram: indivíduos com a idade semelhante aos demais grupos de estudo; indivíduos que não fizeram uso de qualquer medicamento por pelo menos um mês antes da coleta
saudáveis no momento da coleta e que não possuem doenças crônicas. Adotamos como critério de exclusão do estudo os indivíduos com qualquer tipo de neoplasia prévia e aqueles com diagnóstico de infecção urinária no momento da coleta de
ados demográficos e clínicos sobre os grupos de estudo
Grupos de estudo ST CR OT
8 8 5
4,4 6, 2 3, 2
50 ± 6 46 ± 12 43 ± 40 - 56 28 - 64 31-54 Tempo desde o transplante (anos) 9 ± 7 11 ± 3 16
6 , 2 3 , 5 4 , 1 3,87 ± 1,24 4,57 ± 1,98 (n=7) n/a = 1 0 (n=2) 3 (n=2) 4 (n=1) , N) 4 , 2 3 , 1 2 , 2 (Y, N) 3 , 5 5 , 3 1 , 4 2 , 4 4 , 2 1 , 2
Tempo sem o uso de medicamento (anos) n/a n/a 4,7 (1,5
tratamento com imunossupressores (ST, indivíduos com função estável do enxerto; CR, indivíduos com rejeição crônica) e os grupos que não estão sob tratamento de imunossupressores (OT, indivíduos tolerantes operacionais; HE, voluntários saudáveis); m, masculino; f, feminino; n/a, não se aplica; S/N, sim/não. Os dados numéricos são dados como média ± desvio padrão (SD). Para mais detalhes sobre os dados
dos sujeitos da pesquisa veja Anexo III
Como critério de função renal “normal” foi adotado o limite de
creatinina >45 ml/min, não apresentando variação negativa de clearance maior do que 10% nos últimos 6 meses ou níveis considerados dentro da normalidade de creatinina sérica nos últimos 6 meses.
No grupo CR, os indivíduos com rejeição crônica tiveram o seu diagnóstico confirmado por biópsia renal que foi analisada de acordo com a classificação histopatológica do rim transplantado – Banff 1997 (Racusen e cols., 1999). Nesta pesquisa estão disponíveis no anexo III, assim como o documento de aprovação do
doadores de pacientes transplantados Os critérios de seleção do grupo HE foram: indivíduos com a indivíduos que não fizeram uso de mês antes da coleta; e indivíduos saudáveis no momento da coleta e que não possuem doenças crônicas. Adotamos como critério de exclusão do estudo os indivíduos com qualquer tipo de neoplasia prévia e aqueles com diagnóstico de infecção urinária no momento da coleta de
ados demográficos e clínicos sobre os grupos de estudoa
OT HE 5 9 3, 2 4, 5 ± 9 38 ± 8 54 30 - 52 9 n/a 4 , 1 n/a 0 (n=2) 3 (n=2) 4 (n=1) n/a 2 , 2 n/a 1 , 4 n/a 1 , 2 n/a 4,7 (1,5-8) n/a
tratamento com imunossupressores (ST, indivíduos com função estável do enxerto; CR, indivíduos com rejeição crônica) e os grupos que não estão sob tratamento de imunossupressores (OT, ; f, feminino; n/a, não se aplica; S/N, sim/não. Os dados numéricos são dados como média ± desvio padrão (SD). Para mais detalhes sobre os dados
te de clearance de creatinina >45 ml/min, não apresentando variação negativa de clearance maior do que 10% nos últimos 6 meses ou níveis considerados dentro da normalidade de
No grupo CR, os indivíduos com rejeição crônica tiveram o seu diagnóstico confirmado por biópsia renal que foi analisada de acordo com a classificação Banff 1997 (Racusen e cols., 1999). Nesta
classificação de 1997, o termo rejeição crônica era englobado dentro da terminologia nefropatia crônica do transplante. Em todos os pacientes incluídos neste grupo, nas biópsias renais foram observados achados histopatológicos de fibrose intersticial e atrofia tubular, além de fibrose vascular e neoproliferação intimal. Além disso, dispúnhamos da pesquisa de C4d pelas técnicas de imunofluorescência ou imunoperoxidase. Desta maneira, pudemos classificar as biópsias como, rejeição crônica mediada por células T ou por anticorpos, segundo a classificação de Banff-2005 (Solez e cols., 2007).
Foram realizadas três coletas seriadas de material biológico dos sujeitos de pesquisa, em intervalos de 4 a 6 meses entre as coletas. Além disso, os indivíduos do estudo foram acompanhados por um período de 12 a 18 meses.
Para a realização dos experimentos programados, foram realizadas coletas de 55 ml de sangue, sendo 10 ml em tubo seco para separação de soro, 5 ml em tubo com EDTA para extração de RNA e de 40 ml em tubos com heparina para separação de plasma e células mononucleares.
4.1.2 Anticorpos para captura
Foi feito um teste ELISA de ligação direta para selecionar os anticorpos que tivessem melhor grau de ligação as moléculas de IgG ou IgM. Para a padronização deste experimento as placas foram sensibilizadas com moléculas de IgG e IgM disponíveis comercialmente.
Contra os poços que foram sensibilizados com IgG humana foram usados os anticorpos Ab 07, Ab 19, Ab 71 e Ab 20 (Tabela 02). Já nos poços sensibilizados com IgM humana foram utilizados os anticorpos Ab 70 e 72, sendo que foram utilizadas duas alíquotas diferentes do Ab 70 (Tabela 02). Os anticorpos testados foram utilizados em duas titulações diferentes: 1:2.500 e 1:10.000. Para as sensibilizações utilizaram-se três concentrações distintas de IgG e IgM humanas: 1ug, 0,5ug e 0,1ug.
Para a revelação foram utilizados o Ab 03 contra os anticorpos feitos em coelho e o Ab 13 contra os anticorpos feitos em cabra, ambos utilizados na titulação 1:5.000. Não foi necessário o uso de anticorpos secundários contra o Ab 19 e o Ab 72 pois já são conjugados a fosfatase alcalina.
Tabela 02. Anticorpos utilizados para o teste de captura
CÓDIGO DESCRIÇÃO MARCA NÚMERO DE