D IMENSION 1: K NOWLEDGE AND ATTITUDES

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a caracterização dos fenótipos foram escolhidos com base na literatura (Tabela 2.3). Marcadores espécie-específicos foram utilizados para o cabeça-seca e o colhereiro (TOMASULO-SECCOMANDI et al., 2003; SAWYER e BENJAMIN, 2006). Como não existem microssatélites descritos para a garça-branca-grande, foram utilizados marcadores descritos para Ardea herodias (MCGUIRE E NOOR 2002), cuja amplificação foi padronizada em Ardea alba por Souza (2008). Testes de amplificação foram também feitos em todas as espécies estudadas, com os locos descritos para cabeça-seca (TOMASULO-SECCOMANDI et al., 2003), colhereiro (SAWYER E BENJAMIN, 2006) e Ardea herodias (MACGUIRE E NOOR, 2002). Foram testados também os locos Eru04 e Eru09 descritos para

Eudocimus ruber (Aves: Threskiornithidae) (SANTOS et al., 2005) e o loco Nnf5,

descrito para Nipponia nippon (JI et al. 2004). Porém, o iniciador Nnf5 não amplificou em nenhuma das três espécies e os iniciadores Eru04 e Eru09 amplificaram somente no colhereiro, mas não foram polimórficos numa amostra de 10 indivíduos de diferentes colônias reprodutivas.

As reações de amplificação dos marcadores foram realizadas dentro de uma câmara de fluxo laminar e tanto os materiais plásticos utilizados quanto o local de trabalho foram esterilizados com radiação com luz ultravioleta (UV) durante, ao menos, 10 minutos antes do inicio da preparação das reações de amplificação. Para minimizar riscos de contaminação, o DNA molde foi colocado nos tubos de 0,2 ml utilizando-se ponteiras com filtro (Axygen, Union City, CA, EUA). Todas as reações de amplificação foram realizadas utilizando-se um aparelho termociclador Eppendorf Mastercycler®

Miño, CI Material e Métodos

Tabela 2.3. Locos de microssatélites que amplificaram com sucesso em Mycteria

americana, Platalea ajaja e Ardea alba. Para cada loco apresentam-se o nome do

oligonucleotídeo iniciador, as suas sequências (forward: F e reverse: R) e a temperatura de hibridação (T ºC) utilizada no presente estudo.

Espécie Loco Seqüência dos iniciadores (5´- 3´) TºC Mycteria americana1 WS 03 F-AGAAGCCAAATTGATTAGA

R-ACAAAGTTGCGGAGAA 60°C WS 08 TGTCTTTCCAGGTAGTTTT TACAACTGTTCGTGCTTT 60°C WS 0λ GGTAACAGCGAGTTGGAT TAATGCCAATAAGTGCTTAG 60°C WS 13 AGGGCTCATCAATAGTGT GTTTGCCCACTGTGTCAACT 60°C WS 14 AAATGAGCACGGTATT GTTTCTGTGTTAGTGGCTAAG 60°C WS 18 CATATACTAACTGGGTTTAATC GTTGTTCTGCGTTATTC 55°C WS 20 CGGGCCTTTATCTATC ACAGTACCAAACCATTCA 55°C WS 23 TTTTGGTGGGATTCATA ATAAAAGGGTTAGAAAGACT 55°C WS 24 GTAAGGCATGAGAGACTAAG GTGTGATTTAGGATTGTT 55°C

Platalea ajaja2 Aaj 1 F-GATCACCACCATCTTAAATGATAA R-CTTCTGTTTGCCTCACATGG 55°C Aaj 2 F-CTTGATGCAAAGGAAACATCC R-GAGGTGCTTCCAGTTTCCTG 55°C Aaj 3 F-CCCATGGCCACATTATAAACTT R-GCTCTGGAGTAACTTGCTGGA 55°C Aaj 5 F-GGCTGAACACTGTTGTGCTCT R-GAACCAAGCCTCCCTGAATA 58°C WS 03 F-AGAAGCCAAATTGATTAGA R-ACAAAGTTGCGGAGAA 60°C

Ardea alba3 _{Ah211 F-GCTCATCAGGAGTTGAATCTGGC}

R-TCTGTCATTCAGCAATGGACC 57ºC Ah217 F-GCTCAGGCTCTGCTTTGTCTAC R-CACAGATTCAAAACAAGCACCATGC 57ºC Ah320 F-TTAGGAGCAAGATTTTAAAGAAGGTGC R-AAGTGCTGGGTCATACTGGAATAG 55ºC Ah414 F-CATTCCAGCTGCTCTTCATTCTTG R-GGCAAAAGCAACTAGGGGC 56ºC Ah522 F-TTGTGGGACTAAACAGTGAAGCAG R-CAAAGCTGATTTAAAGATGTTCCATCCC 56ºC Ah630 F-TCCTCCTTCACAATGCTACTTGC R-CGGCAGGCAGTATTATTTCAGTGG 55ºC WS 03 F-AGAAGCCAAATTGATTAGA R-ACAAAGTTGCGGAGAA 60°C

1) Tomasulo-Seccomandi e cols., 2003; 2) Sawyer e Benjamin, 2006; 3) MacGuire e Noore, 2002 (locos desenvolvidos em Ardea herodias).

As reações de amplificação dos marcadores de microssatélites seguiram protocolos diferentes para cada espécie, como descritos em seguida:

Miño, CI Material e Métodos

 Cabeça-seca: As reações de amplificação tiveram volume final de 10 µl, com: tampão para PCR (10 mM Tris pH 8,8 25°C; 50 mM KCl; 0,8% Nonidet P40), 2,5 mM MgCl2, 0,15 mM dNTPs (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra), 0,5 U

Taq DNA Polimerase (Fermentas Inc., Glen Burnie, MD, EUA) e aproximadamente 50

ng de DNA molde. As concentrações dos oligonucleotídeos iniciadores forward e

reverse (marcados com os fluorocromos HEX e FAM; Alpha DNA, Montreal, Quebec,

Canadá) variaram entre 0,16 µM e 0,80 µM para permitir a realização de reações de amplificação com vários iniciadores simultaneamente. O programa de amplificação foi o seguinte: desnaturação inicial por 5 min. a 94ºC; cinco ciclos a 94ºC por 20 s., 20 s. à temperatura de hibridação mais alta dos iniciadores utilizados e 20 s. a 72ºC; 21 ciclos a 94ºC por 20 s., 20 s. à temperatura de hibridação mais alta (diminuindo-se -0,5ºC por ciclo, touchdown) e 20 s. a 72ºC; 10 ciclos a 94ºC por 20 s., 20 s. à temperatura de hibridação mais baixa e 20 s. a 72ºC; extensão final de 10 min. a 72ºC seguida de manutenção dos tubos a 4ºC até a sua retirada do aparelho de ciclagem térmica.

 Colhereiro: As reações de amplificação tiveram volume final de 10 l, com: tampão de PCR com 10 mM Tris pH 8,8 25°C; 50 mM KCl e 0,8% Nonidet P40 (Fermentas Inc., Glen Burnie, MD, EUA), 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM de cada iniciador

(marcados com os fluorocromos HEX e FAM, Alpha DNA, Montreal, Quebec, Canadá), 150 M de cada dNTP (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra), 0,5 U Taq DNA Polimerase (Fermentas Inc, Glen Burnie, MD, EUA) e aproximadamente 40 ng de DNA molde. O programa de amplificação incluiu: denaturação da dupla fita de DNA por 3 min a 94°C, seguida de 35 ciclos de 50 s. àa 94°C, 50 s. à temperatura de hibridação de cada iniciador e extensão por 50 s. a 72°C, seguidos de um passo final de extensão por 5 min. a 72°C, e manutenção dos tubos a 4ºC até a sua retirada do aparelho de ciclagem térmica.

 Garça-branca-grande: As reações de amplificação dos microssatélites utilizados basearam-se nos protocolos padronizados por Souza (2008), com algumas modificações, dependendo do loco:

 Para os locos Ah211 e Ah320, as reações tiveram volume final de 15 l, comμ tampão para PCR [75 mM Tris HCL pH 9,0 25°C; 50 mM KCL; 20 mM (NH4)2SO4;

(Biotools B&M Labs, S.A., Madrid, Espanha)], 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs

Miño, CI Material e Métodos

reverse, marcados com os fluorocromos TET e HEX) e aproximadamente 100 ng de

DNA genômico como molde. O programa de amplificação começou com um ciclo de desnaturação à 94ºC por 90 s., seguido por 30 ciclos de: 94ºC por 30 s., hibridação à temperatura específica do iniciador (MCGUIRE E NOOR, 2002) por 30 s. (redução de 0,1ºC por ciclo, touchdown), extensão a 72ºC por 45 s., seguidos de um passo final de extensão à 72ºC por 10 min., e manutenção dos tubos à 4ºC até a sua retirada do aparelho termociclador.

 Para os locos Ah414, Ah217, Ah522 e Ah630 foram utilizados protocolos diferentes dos anteriores, pois os oligonucleotídeos forward usados na amplificação desses locos traziam uma “cauda M13”, permitindo a utilização do protocolo de marcação fluorescente dinâmica (BOUTIN-GANACHE et al., 2001; SCHUELKE et al, 2000) (detalhes dessa metodologia estão no Apêndice C).

O rendimento dos produtos de amplificação foi avaliado através de eletroforese em géis de agarose (2%, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, EUA), corados com Brometo de Etídeo (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, EUA). Depois da eletroforese a 10 V/cm durante 25 minutos em cuba para eletroforese horizontal (Gibco BRL, New York, EUA), visualizaram-se as bandas relativas aos fragmentos amplificados nos géis, utilizando-se um transiluminador MacroVue UVis-20 (Hoefer Inc., San Francisco, EUA) e lâmpadas de luz ultravioleta (GE Healthcare do Brasil Ltda., São Paulo, Brasil). Os produtos que apresentaram bandas intensas e nítidas sob luz UV foram utilizados em seguida para determinação dos fenótipos em locos múltiplos de cada indivíduo.