IGRT og bildebasert verifikasjon

Glicina ´e o mais simples dos amino´acidos prot´eicos existentes, cuja cadeia lateral ´e um ´atomo de hidrogˆenio, sendo por isso, o ´unico n˜ao quiral. Na forma gasosa, ela se apresenta em forma n˜ao-iˆonica, enquanto que em solu¸c˜aon (no ponto isoel´etrico caracter´ıstico) ou em cristal, ela assume uma forma iˆonica chamada de zwitterion (Figura 4). A forma iˆonica depende do ambiente em que a mol´ecula est´a inserida, pois em solu¸c˜ao ´acida, em que h´a excesso de hidrogˆenio (H+_{), o grupamento carboxila (COO}−_{) se neutraliza dentro} da faixa de tamponamento, fazendo com que a mol´ecula apresente uma carga formal positiva, de forma a manter uma certa neutralidade na solu¸c˜ao. Nessa mesma tendˆencia, glicina em meio b´asico (com excesso de OH−_{, doa um hidrogˆenio do grupamento amina} (NH+

3) para a solu¸c˜ao, fazendo com que a mol´ecula apresente uma carga formal negativa. Apesar dessa zwitterioniza¸c˜ao causar um aumento na energia em rela¸c˜ao `a forma gasosa, acredita-se que a forma iˆonica ´e a “preferida” tanto nos cristais quanto em solu¸c˜ao, pois sua estabilidade ocorre atrav´es de liga¸c˜oes de hidrogˆenio, potencializadas na forma iˆonica. Dada sua simplicidade molecular e seu tamanho diminuto, a glicina apresenta a van- tagem evolutiva de poder se “infiltrar” em posi¸c˜oes da cadeia pept´ıdica que nenhum outro amino´acido poderia, pois isso acarretaria em um aumento das tens˜oes envolvidas para es- tabilidade da estrutura prot´eica e, dessa forma, em um aumento da energia necess´aria para manter a estrutura. Como exemplo dessa vantagem, apenas a glicina pode ser o amino´acido interno na h´elice de col´ageno. Nesse caso, sua presen¸ca chega a um ter¸co dos amino´acidos presentes, enquanto que em geral a presen¸ca de glicina em prote´ınas ´e rela- tivamente baixa. Ainda em prote´ınas como citocromo C, mioglobina e hemoglobina, ela oferece grande estabilidade estrutural, pois qualquer outro amino´acido (inevitavelmente com uma cadeia lateral maior) substituindo-a, poderia levar `a quebra da estrutura prot´eica [4, 11]. Do ponto de vista fisiol´ogico, a glicina atua como mediadora de neurotransmiss˜ao

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Figura 4: Representa¸c˜ao esquem´atica da mol´ecula de glicina (a) n˜ao-iˆonica (gasosa); e (b) em forma iˆonica (zwitterion).

inibidora, que ´e essencial em respostas por reflexo, controle do motor volunt´ario e o pro- cessamento de sinais sensoriais no sistema nervoso central de mam´ıferos [5]. Receptores de glicina est˜ao entre os receptores inibidores mais amplamente distribuidos no sistema nervoso central e, dessa forma, eles se tornaram alvos de intensos estudos para desvendar seus mecanismos de a¸c˜ao [5, 6].

Muitos estudos em sua forma molecular foram realizados, principalmente para se es- tabelecer qual estrutura conformacional apresenta maior estabilidade ou, em termos da grandeza estudada, busca-se a estrutura que apresente a menor energia para forma¸c˜ao. Nesse sentido, a busca maior tem sido na determina¸c˜ao atrav´es de experimentos e simu- la¸c˜oes da forma gasosa da glicina (4-a), pois ela apresenta um maior n´umero de possibili- dades conformacionais. Al´em disso, a glicina na forma zwitterionica apresenta dificuldades relativas ao c´alculo te´orico, pois o processo de minimiza¸c˜ao de energia geralmente leva a uma estrutura n˜ao iˆonica (“transferˆencia” de hidrogˆenio do grupo amina para o carbox- ila) ou geometrias inst´aveis, detectados pela presen¸ca de vibra¸c˜oes negativas resultantes dos c´alculos te´oricos de an´alise dos modos vibaracionais [12]. Para resolver esses proble- mas em busca de uma geometria aceit´avel ´e necess´aria a inclus˜ao de efeitos de solvente (continuum) al´em da inclus˜ao expl´ıcita, em alguns casos, de mol´eculas do solvente em considera¸c˜ao (e.g., mol´eculas de ´agua). Nesse sentido Godfrey e Brown [13] analizaram o espectro rotacional de 2 dentre 7 conforma¸c˜oes de glicina, sendo as mol´eculas estudadas as que apresentaram maior estabilidade. Para isso, eles fizeram substitui¸c˜oes isot´opicas (trocar ´atomos de hidrogˆenio por de deut´erio na mol´ecula) em todos os ´atomos “pesados” que comp˜oem a mol´ecula. As mol´eculas analizadas apresentavam a estrutura n˜ao-iˆonica. Os resultados foram comparados com c´alculos ab initio para se determinar a diferen¸ca en-

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erg´etica de cada conforma¸c˜ao, de forma a se estabelecer qual das estruturas seria a mais est´avel. Reva et. al. [14] realizaram experimentos de espectroscopia no infravermelho (IR) para caracteriza¸c˜ao de diferentes configura¸c˜oes de glicina e seus isotopomeros (glic- ina substitu´ıdas por seus an´alogos deuterados) em fase gasosa em ambiente inerte com g´as de Ne, Ar e Kr. O m´etodo de espectroscopia vibracional ´e de aplica¸c˜ao limitada, pois as intensidades de transi¸c˜ao no espectro de microondas s˜ao proporcionais ao quadrado do momendo de dipolo das mol´eculas, de forma que desvios na orienta¸c˜ao do mesmo, que podem estar relacionados com diferentes conforma¸c˜oes moleculares n˜ao podem ser detectados.

Em um trabalho posterior realizado por Stepanian et. al. [15], foram realizadas medidas de espectroscopia infra-vermelho (IR) em amostras de glicina depositadas em temperaturas entre 19K e 5,5K. Foram analisadas mol´eculas de glicina na fase gasosa em ambiente inerte para trˆes polimorfos, em que dois deles j´a haviam sido comprovados em experimentos anteriores em medidas de espectro de microondas. Entretanto, h´a difi- culdade na detec¸c˜ao de outros tipos de conforma¸c˜oes usando esta t´ecnica, uma vez que as intesidades desse espectro s˜ao proporcionais ao quadrado do momento de dipolo das mol´eculas, fazendo com que desvios na orienta¸c˜ao do mesmo (geralmente relacionadas com diversidade conformacional) dificilmente sejam detectados. Ainda conforma¸c˜oes que apresentem momentos de dipolo relativamente baixos s˜ao pouco prov´aveis de serem de- tectados por espectroscopia de microondas. Eles mostraram que a espectroscopia por infravermelho se torna uma t´ecnica adequada para investiga¸c˜ao conformacional da glic- ina, uma vez que os espectros IR s˜ao extremamente sens´ıveis a liga¸c˜oes de hidrogˆenio intramoleculares. Eles realizaram ainda c´alculos DFT (Density Functional Theory) e MP2 (Moller-Plesset, que ´e um m´etodo ab initio baseado na teoria da perturba¸c˜ao) para conjuntos de bases grandes para simular o espectro IR de forma a interpretar os resulta- dos experimentais. Nesse trabalho, eles observaram o surgimento de uma banda nova no espectro IR quando a temperatura se tornava maior que 13K, que foi evidenciado como sendo um novo conformero que n˜ao havia sido identificado na literatura anteriormente. Os c´alculos de primeiros princ´ıpios mostraram que essa suposi¸c˜ao se mostrou verdadeira. Al´em da glicina e seus conformeros, foram utilizados os respectivos isotopomeros dela (substitui¸c˜ao de ´atomos de hidrogˆenio por de deut´erio). A dizer, foram analisados os isotopomeros: glicina (glicina − d0), C, C − d2− glicina, N, N, O − d3− glicina, al´em das glicinas totalmente deuteradas. Por fim, eles demonstram que m´etodos baseados a partir da teoria do funcional da densidade (DFT) com funcionais h´ıbridos (B3LYP) produzem estruturas para os conformeros da glicina em excelente concordancia com os dados ex-

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perimentais e praticamente idˆentico aos resultados por MP2, o que ´e uma vantagem do ponto de vista do custo computacional.

Embora a forma zwitterionica da glicina n˜ao apresente a versatilidade conformacional da fase gasosa, Chakraborty e Manogaran [12] realizaram c´alculos ab initio dos modos vibracionais para mol´eculas de glicina em sua estrutura zwitterionica atrav´es do m´etodo de Onsager para determina¸c˜ao de um meio cont´ınuo, a fim de aplicar efeitos corretivos aos resultados obtidos para uma mol´ecula isolada relacionados com as intera¸c˜oes intermolecu- lares tanto glicina-glicina quanto glicina-solvente. Foi mostrado que a escolha apropriada do conjunto de base juntamente com as constantes diel´etricas e raio de cavidade, al´em da aplica¸c˜ao de um fator de escala corretivo arbitr´ario incluem de maneira satisfat´oria esses efeitos. Dessa forma, pode-se comparar de maneira bem sucedida os resultados da simula¸c˜ao com os resultados experimentais. A superf´ıcie de energia potencial (potential energy surface - PES) ab initio de glicina na fase gasosa foi estudada extensivamente. Entretanto, estudos te´oricos da forma zwitterionica s˜ao relativamente poucos, pois tenta- tivas de se estudar glicinas zwitterionicas isoladas usando m´etodos ab initio n˜ao tˆem sido bem sucedidads devido `as dificuldades citadas anteriormente.

Recentemente, Fischer et. al. [16] realizaram experimentos e c´alculos de primeiros princ´ıpios (DFT/B3LYP e HF) para determina¸c˜ao e caracteriza¸c˜ao por espectroscopia de infravermelho (IR) em mol´eculas de glicina e glicilglicina. Foram consideradas as estruturas zwitterionicas nos c´alculos, e notaram que essa deve ser a estrutura presente durante as medidas realizadas. Para o experimento, solu¸c˜oes de glicina e glicilglicina foram colocadas em v´arios ambientes alcalinos (KBr, KCl, NaI, NaCl, NaBr, CsI e CsCl). Foi percebido que as diferen¸cas de energia entre poss´ıveis conformeros zwitterionicos s˜ao bastante baixas (menores que 330 cm−1_{) e que n˜ao h´a nenhuma descri¸c˜ao consistente} relacionada sobre a preferˆencia de estabilidade de uma conforma¸c˜ao em detrimento `a outra.

Messer et. al. [17] levaram em considera¸c˜ao a dependˆencia da estrutura eletrˆonica da glicina com o pH, uma vez que amino´acidos individuais existem como c´ations em meios ´acidos, zwitterions com carga total nula em pH intermedi´arios, e como ˆanions em solu¸c˜oes b´asicas, onde se deve entender com pH intermedi´ario, ´acido e b´asico aqueles valores pr´oximos, menores e maiores que o ponto isoel´etrico, respectivamente. Essa forte dependˆencia do pH do estado de cargas ´e refletido na sensibilidade a mudan¸cas no am- biente das propriedades de pept´ıdeos e prote´ınas constru´ıdos a partir de amino´acidos individuais. Foram medidos os espectros K-edge dos ´atomos pesados (carbono, nitrogˆenio