Identification, isolation and characterization of radioactive particles

O presente trabalho tem como objetivo o estudo da estrutura de

polissacarídeos sulfatados presentes na alga verde Codium isthmocladum e suas potenciais atividades na coagulação e angiogênese.

2.2 – Objetivos Específicos

 Isolar e caracterizar polissacarídeos sulfatados da alga verde Codium

isthmocladum;

 Caracterizar os polissacarídeos sulfatados nativos e dessulfatados empregando técnicas de metilação e acetilação seguidas de cromatografia a gás e espectrometria de massa (GC-MS) e ressonância nuclear magnética (RMN);

 Investigar as atividades anticoagulantes e antitrombóticas in vitro das

galactanas sulfatadas de C. isthmocladum em comparação com heparina de

mucosa intestinal suína;

 Investigar as atividades antitrombóticas e hemorrágica in vivo das galactanas

sulfatadas de C. isthmocladum em comparação com heparina de mucosa

intestinal suína;

 Investigar a interação das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum com serpinas (Antitrombina) e serino-proteases da coagulação (trombina e Xa);  Investigar o efeito citotóxico das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum em

culturas de células endoteliais e tumorais;

 Investigar os efeitos anti-proliferativos das galactanas sulfatadas de C.

isthmocladum em culturas de células endoteliais e células tumorais;

 Investigar o efeito das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum na adesão e migração de células endoteliais;

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 Investigar a expressão de glicosaminoglicanos sulfatados em células endoteliais expostas a galactanas sulfatadas de C. isthmocladum;

 Determinar o efeito das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum na formação de estruturas tipo capilar por células endoteliais cultivadas sobre membrana basal reconstituída (Matrigel);

 Desenvolver sondas das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum para estudos de interação celular;

 Investigar a interação das galactanas sulfatadas de C. isthmocladum em cultura de células endoteliais aderidas e em suspensão.

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3 – MATERIAIS

3.1 – Material biológico Filo: Clorophyta Classe: Clorophycea Ordem: Bryopsidales Família: Codiales Gênero: Codium Espécie: C. isthmocladum

Figura 9. Macroalga marinha verde Codium isthmocladum empregada neste trabalho. Seta indica a alga objeto deste estudo.  A alga foi coletada em marés baixas entre 0,0-0,2 m, em temperatura situada entre 28-32 °C.

3.2 – Linhagens celulares

Para os estudos realizados nesse trabalho, foram utilizadas as células endoteliais da aorta de coelho (RAEC, rabbit aorta endothelial cell), clone ClPs, que foram gentilmente cedidas pelo Dr. V. Buonassisi (Buonassisi, 1973). Em alguns experimentos, foram também utilizadas as células: Caco-2, linhagem estabelecida de células de tumor de cólom-retal (tumor primário) humano (American Type Culture Collection, HTB-37™); HCT 116, linhagem estabelecida de células de carcinoma coloretal humano (American Type Culture Collection, CCL-247™); PC-3, linhagem estabelecida de células de adenocarcinoma de próstata humano (grau IV) derivada de metástase óssea (American Type Culture Collection, CRL-1435™); DU145, linhagem estabelecida de células de carcinoma de próstata humano (American Type Culture Collection HTB-8™); fibroblastos humanos

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3.3 – Animais

Ratos Wistar machos, adultos de 3 a 5 meses de idade, com massa entre 250 e 350g, originados da colônia 2 BAW (VALLE, 1949), oriundos do Biotério do Departamento de Farmacologia e do Biotério Central da Escola Paulista de Medicina (UNIFESP). Todos os protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal da Universidade (Valle, 1949) de acordo com a lei federal brasileira que leva em consideração os 3 Rs.

3.4 – Polissacarídeos sulfatados e monossacarídeos

Condroitim 4-sulfato (extraído de cartilagem de baleia), condroitim 6-sulfato (de cartilagem de tubarão) e dermatam sulfato (de pele de porco) foram adquiridos da Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio, Japão). Heparam sulfato foi purificado de pulmão bovino em nosso laboratório (Gomes and Dietrich, 1982). Heparina de mucosa intestinal suína da Kim Master com 162 UI/mg (Passo Fundo, RS, Brasil). D-galactose, fucose, glucose, ramnose, arabinose, manose, galactose, e xilose foram adquiridas da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).

3.5 – Plasma humano

Foi preparado conforme recomendações da United States Pharmacopea

(USP). O sangue de doadores voluntários do sexo masculino foi coletado sobre citrato de sódio (concentração final 0,82%), sob agitação leve, em frasco de polietileno esterilizado. O plasma foi separado por centrifugação e alíquotas de 10 ml foram estocadas a -20°C em frascos de vidro esterilizados.

3.6 – Enzimas, serpinas, substratos cromogênicos e reagentes para testes de coagulação

 Maxatase (protease alcalina P126) foi adquirida da Biocon do Brasil Indústria Ltda (RJ, Brasil). Viocase extraída de pâncreas de porco, foi adquirida da Gibco (life Technologies, Rockville, MD, EUA), a qual contém uma mistura de esterases, peptidases, nucleases, elastases e colagenases.

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 Heparinase foi purificada de Flavobacterium heparinum como descrito (Nader et al., 1990).

 Fator Xa bovino, Trombina bovina (Fator IIa) e Antitrombina Humana (Actichrome® American Diagnostics Inc., Stamford, CT, EUA); HCII purificado (Diagnostica Stago, Gennevieres, França)

 Heptest (Haemochem, St. Louis, MO) composto por fator Xa bovino e Recalmix®

 -Trombina para ensaio de tempo de trombina (Enzyme Research, South Bend, IN, EUA).

 Kits para APTT®

(tempo de tromboplastina parcial ativada) e para PT® (tempo de protrombina) (General Diagnostics, Morris Plains, NJ, EUA); e kit para ACT (tempo de coagulação ativado) ativado por celite (Hemochron, International Technidyne, Edison, NJ, EUA); kit para TGA (“thrombin generated assay) Technothrombin® TGA Technoclone, Austria).

 Agonistas para agregação plaquetária: ADP, colágeno e adrenalina (Chronolog Corporation, Havertown, PA).

 Substrato cromogênico para trombina (Spectrozyme TH) (HDCT-Ala-Arg-pNA) e substrato cromogênico para fator Xa Spectrozyme FXa (CH3OCDHG-Gly-Arg- pNA) (American Diagnostica, Greenwich, CT).

3.7 – Meios de cultura e outras soluções

 Mistura nutriente F12 com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, proveniente da GIBCO (Grand Island, NY, USA) e Penicilina/Estreptomicina (Penicilina- Estreptomicina liofilizada em pó, 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por ml em cloreto de sódio 0,9%) da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) contendo 10% de soro fetal bovino da Cultilab (Campinas, São Paulo) para o cultivo de células.

 DMEM (DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium) e meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute da GIBCO (Grand Island, NY, USA).

 Solução EBSS (solução salina balanceada de Earle sem cálcio e sem magnésio) preparada em nosso laboratório contendo 6,8g NaCl; 0,4g KCl; 1,14g

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Na2HPO4; 0,2g KH2PO4; 0,14g Na2HPO4 x 1 H2O; 2,2g NaHCO3; 1,0g D-glucose

e 0,01g de vermelho de fenol em um litro de água.

 Solução PBS (phosphate-buffered saline) sem cálcio e sem magnésio foi preparada em nosso laboratório contendo 7,2g de NaCl; 1,48g Na2HPO3 e 0,43g

KH2PO4 pH 7,4. Coquetel de inibidores de proteases: ácido -aminocapróico

0,1M, benzamidina 6,5 mM, iodoacetamida 5,5 mM e PMSF (fluoreto de fenil metil sulfonil) 0,1 mM.

 Solução de Revelação ("enhancement solution") da Perkin-Elmer Life Sciences (Turku, Finland).

 Tampão para ensaio fluorimétrico: 0,05 M Tris-HCl pH 8.

Essas soluções foram preparadas com água deionizada em sistema Milli- Q™ Water System, Millipore Corp. (Bedford, MA, EUA).

3.8 – Reagentes utilizados nos ensaios de microscopia confocal, citometria de fluxo e proliferação celular.

 Anticorpo policlonal anti-fibronectina (BD Biosciences, Franklin Lakes, EUA).  Anticorpo monoclonal (IgG) contra a porção N-terminal do sindecam-4 (MoAb-

Synd4, clone 4E12A8), produzido em camundongo em nosso laboratório.

 Anticorpos secundários: anti-IgG de coelho conjugado com Texas Red e anticorpo anti-IgG de camundongo, conjugado com Texas Red.

 DAPI (4’-6- diamino-2- fenilidole, dihidrocloreto) (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA).

 Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) (Amershan, Piscataway, NJ) e estreptavidina conjugada com FITC (Jakson Imuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA).

 Kit para proliferação celular (cell proliferation ELISA, BrdU, chemiluminescent) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).

 Lectina WGA conjugada com AlexaTM 488 (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA).

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 Meio de montagem aquoso Fluoromount-G da Electrom Microscopy Sciences (Ft. Washington, PA, EUA).

 p-Formaldeído 20% (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA) 3.9 – Outros materiais

 [35

S]-sulfato de sódio, do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, IPEN (São Paulo, SP, Brasil).

 1,2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, brometo de cetiltrimetilamônio

(CETAVLON), ácido isobutírico, piridina (Aldrich Chemical Co. Inc., Millwaukee, WI, EUA).

 Ácido acético, acetato de sódio, acetona, anidrido acético, cloretos de sódio, cálcio e magnésio, etanol, metanol, n-butanol, sulfato de sódio, tiossulfato de sódio, glicina (Merck, Darmstadt, Alemanha).

 Ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido -aminocapróico e floroglucinol (Merck, Darmstadt, Alemanha).

 Agarose (Standart Low-Mr) (BioRad Laboratories, Richmond, CA, EUA).  Água deuterada (99,9%) (Tedia Chemicals, EUA).

 Albumina sérica bovina (BSA) (Fração V); azul de toluidina; DAB (3’,3- diaminobenzamidina); borohidreto de sódio; DMSO (dimetil sulfóxido), EDAC (1- (3’-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida); EDTA (etilenodiamino tetracetato), iodoacetamina; MTT, sal tetrazólio (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]); PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila); saponina, Tris (hidroximetilamino metano); Tween 20 (Polioxietilenosorbitam); uréia ultra pura; vermelho de cresol (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA).

 Bacto-gelatina (Difco Laboratories, Detroit, MI, Eua).

 Biotina-hidrazida (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Eua).  Clorofórmio (Tedia Chemicals, EUA)

 Colunas de gel filtração TSK-Gel™ 2000 e TSK-Gel™ 3000 (9.4 mmD x 25 cm) (Supelco, DE, EUA).

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 ECL (Enhanced chemiluminescence) (Amersham Life Science Ltd, Buckinghamshire, Inglaterra).

 Filmes radiosensíveis Multipurpose (12.5 x 19.2 cm, 12.5 x 25.2 cm e 12.5 x 43.0 cm) (Packard Instruments Company, Meriden, USA).

 Filtro para 500 mL com membrana de acetato de celulose 0,22 µm, Modelo 25942 (Corning Laboratory Sciences Co., Corning, NY, EUA).

 Filtro para 150 mL com membrana de acetato de celulose de 0,22 µm, modelo Sterifil D-6S (Millipore Corp., Bedford, MA, EUA).

 Fitas de diálise Spectrapor com poro de 6000 a 8000 Daltons (Spectrum Medical Industries, Houston, TX ,EUA).

 Iodeto de metila (Carlo Erba, Brasil)

 Lamínulas para cultivo de células com 12 mm de diâmetro (Glastécnica,São Paulo, SP, Brasil).

 Leite Molico desnatado (Nestlé, São Paulo, SP, Brasil).

 Líquido de cintilação Ultima Gold da Packard Instruments Co., Downers grove, Il, EUA).

 Fibronectina purificada em nosso laboratório a partir de plasma humano fresco (obtido do Hospital São Paulo - UNIFESP), em cromatografia de afinidade em gelatina-sepharose (Pharmacia, LKB Biotechnology - Uppsala, Sweden), segundo metodologia descrita por (Akiyama et al., 1985).

 Laminina foi purificada a partir do tumor Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (gentilmente cedido pelo professor Silvio S. Veiga, do Departamento de Biologia Celular, UFPR), produzido em camundongos C57BL/10 (fêmeas de aproximadamente 2 meses) por meio de transplante serial por inoculação intramuscular (Kleinman et al., 1985), como descrito por Paulsson (Paulsson et al., 1987).

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 Matrigel purificado em nosso laboratório a partir do tumor murino Engelbreth- Holm-Swarm (condrosarcoma) que é pouco diferenciado e produz grande quantidade de matriz extracelular (Orkin et al., 1977)

 Membrana de nitro celulose (0,45 micron) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

 Papel de cromatografia Whatman nº 1 e 3MM (W & R Balston Ltda., Inglaterra).  Película para raio-X, X-Omat SB-5 (20,3x25,4cm) (Eastman Kodak Co.,

Rochester, NY, EUA).

 Placas de cultura, multiwell de 24 e de 96 poços (Nalge Nunc International Corporation, Naperville, IL, EUA).

 Placas para cultura de poliestireno de 35x10 mm e 60x10 mm (Falcon, New Jersey, EUA).

 Resina de troca iônica Lewatite da Bayer, gentilmente cedida por Açúcar Guarani S/A (Olímpia, São Paulo, lote AD001, safra 95/96); resina DOWEX 50 (H+, 50-100 mesh) (JT Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ, EUA)

 Unidade filtrante para seringa com membrana de acetato de celulose 0,22 m (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA).

Todos os demais reagentes e materiais empregados foram da melhor qualidade disponível.

3.10 – Aparelhos

Além dos aparelhos usuais de laboratório pode-se destacar:  Agitador orbital mod. 255-B (FANEM Ltda., São Paulo, SP, Brasil).

 Agregômetro PACKS-4® _{(Plaquelet aggregation chromogenic kinetics System- 4)}

adrenalina (Chronolog Corporation, Havertown, PA).

 Analisador de coagulação de cinética rápida, ACL 300 Plus (Coulter (Hialeah, FL, EUA).

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 Banhos e estufas de temperatura constante (FANEM Ltda., São Paulo, SP, Brasil).

 Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col. (1968) (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil).

 Centrífuga refrigerada CR 21 (Hitachi Koki Co. Ltd., Tóquio, Japão).

 Citômetro de fluxo modelo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).

 Contador de cintilação em meio líquido, modelo Microbeta Jet 1450 LSC Luminescence Counter (Pekin-Elmer Life Sciences-Wallac, Turku, Finlândia);  Cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa (GC-MS) (Hewlett-

Packard, model 5987-A,

 Densitômetro Quick Scan Flur Vis, Helena Laboratories (Beaumont, TX, EUA) e densitômetro CS-9000 da Shimadzu Corporation (Quioto, Japão).

 Espectrofotômetro UV/visível Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão).

 Espectrômetro de ressonância magnética nuclear Bruker DRX 400 MHz, com probe triplo (Bruker Daltonics, Alemanha)

 Evaporador rotatório Evapo-Mix (Buchler Instruments, Fort Lee, NJ, EUA).  Fibrômetro da Becton Dickinson and Co. (Rutherford, NJ, EUA).

 Fluorímetro RF-5301-PC (Shimadzu, Tóquio, Japão)  Fluxo laminar horizontal (Vecco, Campinas, SP, Brasil).

 Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil).

 Incubadora de CO2, Modelo 315 acoplada a torpedos de CO2 pelo Gás Guard

modelo 3030 (Forma Scientific, Marietta, OH, EUA).

 Leitor de ELISA modelo ELX 800 (Universal Microplate Reader) (Bio-Tek instruments Inc., Highland, WI, Eua).

 Leitor de ELISA para fluorescência, modelo Victor2

1420, com sistema “multlabel counter” (Pekin-Elmer Life Sciences-Wallac, Turku, Finlândia).

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 Leitor de ELISA para fluorescência em microplacas Tecan Infinite®

M200 (Tecan Group Ltd., Suíça) com software específico para avaliação do Technothrombin® TGA.

 Liofilizador modelo Flexy-Dry (FTS Systems, Stone Ridge, NY, EUA).

 Liofilizador modelo Speed-Vac modelo Vr-1 (Heto-Holten A/S, Allerod,

Gydevang, Dinamarca).

 Lumi-Agregômetro (Chrono-Log Corporation, Havertown, PA, EUA).

 Medidor de pH modelo 701 A/digital lonalyzer (Orion Research, Cambridge, MA, EUA).

 Microscópio com aparato para fluorescência, modelo E-600 Nikon (Tóquio, Japão), com sistema fotográfico acoplado, modelo U-III.

 Microscópio confocal de varredura a laser, modelo LSM510 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).

 Microscópio invertido com contraste de fase, modelo TS-300 Nikon (Tóquio, Japão).

 Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA).

 Sistema de estoque de fósforo Cyclone™ (Packard Instrument Company (Meriden, CT, EUA) como software OptiQuantTM, para análise de imagem.

 Sistema de HPLC Waters 845 equipado com software dedicado para análise de polímeros (Millennium 2000). O sistema HPLC consiste de um computador, uma interface LAC/E, duas bombas 510, um auto-injetor 712 WISP, um refratômetro diferencial R401 e um detector de absorbância UV modelo 484 (Waters, Millford, MA, EUA).

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4 – MÉTODOS

4.1 – Purificação das galactanas sulfatadas da alga verde

A alga seca e pulverizada foi tratada com 2 volumes de acetona para despigmentação e delipidação. A acetona foi decantada, e o resíduo colocado para secar a 45 °C sob aeração, aferindo-se o peso seco do material, que se convencionou chamar de pó cetônico. O pó cetônico (100 g) foi dissolvido em 300 mL de NaCl 0,25 M e o pH ajustado para 8.0. A seguir, foi adicionado maxatase (enzima proteolítica de esporobacilos na proporção de 15 mg/g pó cetônico) e a suspensão mantida a 60 ºC por 16 horas, filtrada em pano e o filtrado submetido a centrifugação (10.000 x g, 10 minutos, 4 ºC). O sobrenadante, denominado cru de polissacarídeos, foi fracionado pela adição de volumes crescentes de acetona (1:0.3, 1:0.5, 1:0.7, 1:0.9, e 1:1.2, v/v). Para cada precipitação, o volume de acetona gelada era adicionado sob ligeira agitação e a solução mantida a 4 ºC por 24 horas. Os precipitados formados em cada suspensão foram coletados por centrifugação (10,000 × g, 20 min, 4 ºC), secos, ressuspensos em água destilada e analisados quanto ao conteúdo de açúcares e sulfato.

A fração obtida com 0,9 volumes (F0.9) contendo as galactanas sulfatadas foi complexada com resina de troca iônica Lewatite (5 g F0.9/300 mL de resina em presença de NaCl 0,15 M) sob agitação a 60 ºC por 18 h. A resina foi eluída pela adição “step wise” de molaridades crescentes de NaCl (0,3 a 3,0 M), como descrito por (Dietrich et al., 1995a). Uma vez que os polissacarídeos sulfatados interagem com o corante azul de toluidina, a eluição dos compostos foi acompanhada pelo teste de metacromasia, que consiste na aplicação de uma alíquota (10L) em papel Whatmann nº 1 corado com solução azul de toluidina 0.1%. As amostras que contêm polissacarídeos sulfatados interagem com o corante, e apresentam metacromasia. Os compostos sulfatados foram eluídos com NaCl 2 e 3 M. Essas frações foram denominadas SG1 e SG2, respectivamente, galactanas sulfatadas 1 e 2.

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4.2 – Análises físico-químicas e químicas das galactanas sulfatadas

O grau de pureza das galactanas sulfatadas foi avaliado por eletroforese em gel de agarose no tampão 1,3 diamino propano acetato (PDA) 0,05 M pH 9,0 (Dietrich and Dietrich, 1976). Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico, utilizando-se como padrão galactose, sendo as leituras realizadas a 490 nm (Dubois et al., 1956). O teor de sulfato total foi quantificado, por turbidimetria pelo método da gelatina-bário, tendo-se como padrão o sulfato de sódio (Dodgson and Price, 1962) após hidrólise ácida (HCl 4 M, 6 h, 100 °C), bem como por complexação com azul de toluidina após cromatografia em papel com descrito anteriormente (Nader and Dietrich, 1977). Os tipos de açúcares presentes nas frações foram inicialmente caracterizados após hidrólise ácida dos polissacarídeos (HCl 4 M, 2 h, 100oC) e cromatografia em papel dos hidrolisados, seguida por coloração com nitrato de prata em meio alcalino (Trevelyan et al., 1950). O teor de proteína em cada composto foi determinado por reação com Coomassie blue R 250 e leitura realizada a 595 nm (Spector, 1978).

A massa molecular foi determinada empregando-se cromatografia de gel filtração em cromatógrafo de alta pressão (GPC-HPLC). O sistema de HPLC está equipado com software dedicado para análise de polímeros (Millennium 2000). O sistema HPLC consiste de um computador, uma interface LAC/E, duas bombas 510, um auto-injetor 712 WISP, um refratômetro diferencial R401 e um detector de absorbância UV modelo 484 (Waters, Millford, MA, EUA). As colunas TSK G3000SW e TSK G2000SW estão acopladas e ligadas ao detecto de UV que por sua vez está acoplado em séria ao detector do índice de refração (RI). O perfil de massa molecular foi determinado como descrito (Ahsan et al., 1995). As análises das preparações de galactanas e de heparina foram realizadas injetando-se alíquotas de 32 L (10 mg/mL em sulfato de sódio 0,3 M) ao sistema de GPC– HPLC. O fluxo da fase móvel (sulfato de sódio 0,3 M) foi de 0,5 mL/min e a corrida foi de 65 min. A leitura do UV (234 nm) e a detecção do RI realizada a temperatura ambiente. Após cada corrida, o perfil de eluição de cada amostra foi analisado de acordo com curvas de calibração empregado-se padrões de massa molecular

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conhecida nas mesmas concentrações e volumes utilizados para as amostras testadas.

4.3 – Estrutura das galactanas 1 e 2

A estrutura das galactanas foi investigada após metilação e acetilação do polissacarídeo e os tipos de produtos formados avaliados por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, bem como por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Foram realizados espectros

monodimensionais (1H e 13C) e bidimensionais (COSY, TOCSY, HMQC, HMBC e

NOSY) para as galactanas nativas e dessulfatadas. Esses espectros foram por nós obtidos durante estágio no Centro Nacional de Ressonância Magnética

Nuclear da UFRJ, em colaboração com Prof. Paulo Mourão e Profa. Ana Paula

Valente.

4.3.1 – Dessulfatação

A dessulfatação química das galactanas, foi realizada como descrito (Nagasawa et al., 1979). Cerca de 50 mg de galactanas em 5 mL de água destilada, foram adicionados a resina de troca-iônica DOWEX 50 (H+, 50-100 mesh) até atingir o pH entre 1 e 2. O sobrenadante foi neutralizado com piridina e liofilizado. Ao sal de piridônia foram lentamente adicionados 3 mL de DMSO:metanol (9:1) e mantido a a 80°C até a total dissolução do sal. Após o término da incubação, as amostras, foram colocadas em banho de gelo, a reação interrompida pela adição de 3 mL de água destilada, o pH ajustado para 9.0-9.5, e finalmente dializadas contra água destilada.

4.3.2 – Metilação

As galactanas, nativa e dessulfatada, foram metiladas como descrito por Hakomori (Hakomori, 1964) com as modificações introduzidas por Pantakar (Patankar et al., 1993). Cerca de 10 mg das galactanas foram solubilizadas em 0,2 mL de água destilada e à esta solução adicionado 1 mL de DMSO, 80 mg de NaOH liofilizado e 125 mL de iodeto de metila. A mistura permaneceu sob agitação por 1 h à temperatura ambiente e a reação neutralizada pela adição de 2

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