3. METHODS
3.3 M ICROSCOPY
O carcinoma de células escamosas é a neoplasia maligna mais prevalente da mucosa bucal e seu desenvolvimento está associado a fatores intrínsecos e extrínsecos, principalmente, ao tabaco e ao álcool. Na literatura há evidências de que estes agentes não só participam da gênese do câncer de boca, como também estão associados a um comportamento biológico mais agressivo e, consequentemente, a um pior prognóstico da doença (BROWMAN et al., 1993; Do et al., 2003, PYTYNIA et al., 2004; FORTIN; WANG; VIGNEAULT, 2009). Alguns estudos sugerem que o aumento da imunorreatividade de p53, VEGF e caspase-3 pode estar associado a um estágio clínico mais avançado da doença e apresentar valor prognóstico no CCE de cabeça e pescoço (HAGUE et al., 2004; KYZAS et al., 2005; BOONKITTICHAROEN et al., 2008; BOSLOOPER et al., 2008; M RG RITESCU et al., 2009; CHENG et al., 2011; KATO et al., 2011). Neste estudo retrospectivo, as características clínico-patológicas de CCE bucais, bem como a imunodetecção das proteínas VEGF, caspase-3 e p53 foram comparadas entre lesões de pacientes tabagistas e etilistas com as de indivíduos não expostos a estes fatores de risco.
Corroborando os dados da literatura, no grupo de não tabagistas e não etilistas, a maioria dos pacientes era do sexo feminino, com média de idade superior quando comparados aos indivíduos expostos aos fatores investigados (LINK; KAUGARS; BURNS, 1992; LO et al., 2003; WISEMAN et al., 2003; FARSHADPOUR et al., 2007; KRUSE; BREDELL; GRÄTZ, 2010). Além disso, pacientes não tabagistas e não etilistas apresentaram, principalmente, lesões grau I, enquanto indivíduos tabagistas e etilistas exibiram maior número de lesões grau III. Estes
dados foram também observados por Dahlstrom et al. (2008) e Harris et al. (2010) que encontraram maior percentual de lesões bem diferenciadas em pacientes não expostos aos principais fatores extrínsecos. Outra característica distinta entre os grupos foi o tamanho das lesões, uma vez que pacientes não expostos apresentaram, em sua maioria, tumores com menos de 2 cm de diâmetro, enquanto nos indivíduos tabagistas e etilistas as lesões exibiram diâmetro superior. Kruse, Bredell e Grätz (2010) constataram que a maioria das neoplasias de boca em não fumantes e não etilistas foi T1 ou T2 indo ao encontro dos resultados encontrados no presente estudo. A disseminação metastática não foi avaliada, pois na maioria dos prontuários selecionados estas informações não constavam, não sendo possível investigar o estadiamento clínico da doença.
Apesar das características clínico-patológicas distintas observadas entre os grupos de pacientes com CCE bucal, não foi encontrada diferença significativa quanto à detecção imunoistoquímica de VEGF, caspase-3 e p53. Siegelmann- Danieli et al. (2005) também não encontraram associação da imunodetecção da proteína p53 com o uso do tabaco e do álcool. Foram estudados 45 casos de carcinoma de língua, 30 de pacientes tabagistas (a maioria também consumia álcool) e 15 de não tabagistas. Os autores sugerem que a mutação da p53 seja um evento precoce da carcinogênese bucal. Por outro lado, ao avaliarem carcinomas de cabeça e pescoço e tecidos adjacentes, Brennan et al. (1995) e Van Oijen, Van de Craats e Slootweg (1999) encontraram imunorreatividade superior da p53 em pacientes fumantes. Estes estudos envolveram tumores localizados em laringe, hipofaringe e orofaringe, enquanto o presente restringiu-se a lesões da cavidade bucal.
São escassos os trabalhos que fazem a correlação entre a expressão do VEGF com o alcoolismo e o tabagismo no CCE bucal. Ao estudarem o CCE de boca, Faustino et al. (2008) não encontraram associação significativa entre a expressão do VEGF e características clínico-patológicas como gênero, idade, localização da lesão, grupo étnico, recorrência local e regional, metástases linfonodais ou com os hábitos de tabagismo e etilismo. Kyzas et al. (2005), em um estudo retrospectivo com 69 pacientes com lesões malignas de cabeça e pescoço, observaram correlação significativa entre a expressão deste marcador e um estágio clínico mais avançado da doença. Entretanto, também não encontraram correlação entre a imunorreatividade do VEGF e características clínico-patológicas como idade, graduação histológica, metástases em linfonodos e hábito de tabagismo.
O valor prognóstico da imunodetecção da caspase-3 no carcinoma bucal não é tão claro quanto o das demais proteínas investigadas. Hague et al. (2004) encontraram maior expressão deste marcador em tumores malignos bucais pobremente diferenciados, enquanto Andressakis et al. (2008) não observaram correlação entre as características clínico-patológicas e este marcador em carcinomas de língua. Neste estudo, a imunodetecção da caspase-3 foi superior nos grupos de tabagistas e etilistas quando comparados aos pacientes-controle, embora esta diferença não tenha sido significativa. A literatura é escassa quanto à análise da imunorreatividade dessa proteína em carcinomas bucais, investigando o efeito do fumo e do álcool. Elias et al. (2010) analisaram o efeito citotóxico do extrato do tabaco em culturas de células de tumores malignos epiteliais de boca e observaram que o fumo aumentou significativamente a apoptose nesta neoplasia maligna, o que foi constatado pela ativação da caspase-3.
Para análise quantitativa da imunodetecção dos marcadores estudados foi empregado o método de segmentação semi-automatizada, uma vez que o VEGF e a caspase-3 são detectados no citoplasma das células, o que facilita a ocorrência de vieses ao realizar-se a contagem manual. Utilizando este método foi possível padronizar-se a avaliação da imunorreatividade.
Em nosso estudo retrospectivo foram incluídos casos de carcinoma bucal diagnosticados entre 1991 e 2011, provenientes do arquivo do laboratório do Serviço de Estomatologia do Hospital São Lucas-PUCRS. Uma dificuldade encontrada para avaliação dos hábitos de tabagismo e etilismo foi a falta de informações em alguns dos prontuários analisados, principalmente, em relação ao tipo de bebida alcoólica ingerida e a quantidade de tabaco e álcool consumidos. Por essa razão, não foi possível verificar a correlação entre a quantidade de fumo e de bebidas alcoólicas utilizados com a imunorreatividade de VEGF, caspase-3 e p53.
Foram selecionados pacientes usuários de tabaco e álcool e aqueles que não apresentaram histórico de utilização destas substâncias. Para evitar vieses nos resultados obtidos, foram excluídos pacientes que, no momento do diagnóstico, relataram ser ex-tabagistas e ex-etilistas. Foram excluídos também casos de CCE de lábio, pois esta neoplasia maligna apresenta comportamento distinto ao das demais regiões da cavidade bucal e sua gênese tem forte associação com a exposição solar. Lesões de pacientes imunossuprimidos por HIV, transplantados, usuários de corticosteróides também não foram incluídas, pois esses fatores, além de aumentar as chances de aparecimento de neoplasias malignas, estão relacionados a uma doença mais agressiva. Também foram excluídos tumores que representaram recidivas e lesões de pacientes portadores de leucoplasia verrucosa
proliferativa, que se caracteriza por lesões progressivas, as quais evoluem frequentemente para o CCE e possuem fraca relação com o tabaco e o álcool.
Nosso estudo não demonstrou associação entre exposição ao tabaco e ao álcool com a imunodetecção de p53, VEGF e caspase-3 em CCE bucais. Seria interessante confirmar os resultados apresentados por meio de técnicas que avaliassem também a expressão dos genes VEGF, caspase-3 e p53 como, por exemplo, a PCR (Polymerase Chain Reaction) em tempo real. Entretanto, a extração
de RNA dos espécimes da amostra estudada poderia ser inviável, uma vez que muitos dos casos foram diagnosticados há quase 20 anos. Para a realização dessa investigação seria necessário um estudo prospectivo, sendo o material coletado a fresco e congelado a -80°C. A utilização da técnica de imunoistoquímica no presente estudo permitiu que se obtivesse uma amostra de 90 casos, 30 dos quais provenientes de pacientes não fumantes e não etilistas.
Este estudo mostrou que existem diferenças clínico-patológicas importantes entre carcinomas bucais de células escamosas de pacientes tabagistas e etilistas e de não tabagistas e não etilistas. Neste grupo, as lesões ocorreram preferencialmente no sexo feminino, em uma faixa etária mais avançada, além de predominarem tumores bem diferenciados e de tamanho menor. No entanto estas diferenças não foram confirmadas na análise imunoistoquímica pela detecção das proteínas p53, caspase-3 e VEGF, sugerindo que esta não é influenciada pelo tabagismo e etilismo. Apesar das três proteínas estudadas serem consideradas marcadores prognósticos para o carcinoma bucal de células escamosas, outros eventos moleculares podem estar associados à maior agressividade biológica tumoral nos pacientes usuários de tabaco e álcool.
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