5.2.1. PEG
A adição de PEG nos meios de cultura tem como objetivo a indução de um estresse osmótico simulando o estresse hídrico observado em embriões zigóticos, sujeitos a condições de desidratação (von Arnold et al., 2002). Salienta-se que a parede celular não é permeável às moléculas maiores de PEG, e desta maneira, a célula sofre plasmólise sem que ocorra entrada do composto. Essa situação leva a uma redução na pressão de turgor e a redução do potencial osmótico intracelular (von Arnold et al., 2002). Em P. pinaster a adição de PEG reduziu o crescimento da cultura embriogênica, essencialmente devido à redução da proliferação celular, e ao mesmo tempo propiciou a maturação de embriões somáticos com morfologia
semelhante àquela observada durante a embriogênese zigótica (Ramarosandratana
et al., 2001).
Verificou-se no presente trabalho que a adição de PEG resultou numa redução do crescimento celular (Figs. 4 e 8), associado a uma redução nos níveis de NO (Figs. 5, 6) e ROS (Figs. 7), após 21 dias de cultivo em relação ao controle. Entretanto, os resultados obtidos neste trabalho para o sistema A. angustifolia diferem daqueles observados para outros sistemas vegetais, e que reportam, frequentemente, um aumento de ROS nos tratamentos suplementados com agentes osmóticos (Beligni & Lamattina, 1999; Wei, 2009). Exemplo desse tipo de resposta foi descrito para grãos de cevada, onde o estresse osmótico causado pela adição de PEG, induziu o aumento de ABA endógeno, diminuiu a matéria fresca e seca, e aumentou a concentração de H2O2 em relação ao controle (Wei, 2009). Adicionalmente, sob estresse osmótico, diversas espécies vegetais apresentaram rápida formação de NO, como foi demonstrado em trigo, raízes de A. thaliana e ervilha, tratados com PEG. Nesses sistemas ocorreu aumento da produção de NO em relação ao controle até 36 h após o contato com o agente osmótico, enquanto no período seguinte houve uma estabilização no conteúdo de NO produzido (Kolbert et
al., 2008).
A suplementação com PEG (8000) no cultivo in vitro de Deschampsia
antarctica foi responsável pela diminuição de H2O2. Foi demonstrado, nesse sistema vegetal, que a tolerância ao estresse hídrico está associada com um aumento na atividade de enzimas antioxidantes e com a capacidade de retirar radicais livres (Zamora, 2010).
Em nosso trabalho, os resultados obtidos sugerem que algum mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo pode ter sido ativado após a suplementação de PEG ao meio de cultura, impedindo o aumento no conteúdo de ROS e NO após 21 dias em incubação com este promotor de maturação. Neste sentido, diminuição no conteúdo de NO e ROS em culturas tratadas com agentes osmóticos pode estar associada ao aumento da atividade de enzimas antioxidantes. Análises de expressão e atividade de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase (SOD), catalase e ascorbato peroxidase, durante o período de cultivo das células de A. angustifolia, poderiam confirmar essa hipótese.
5.2.2. Maltose
A maltose, assim como outros carboidratos, atua como uma fonte de carbono e como agente osmótico (Shoji et al. 2006). Sua quebra disponibiliza a glicose, que é prontamente assimilável pelas células vegetais (Salajova et al., 1999). Frequentemente, a utilização de maltose é preferida, em relação à sacarose, por promover um aumento no número de embriões somáticos. Essa situação foi observada para diferentes sistemas de coníferas como em P. elliottii e em P. taeda (Salajova et al., 1999). Atualmente, poucos trabalhos relatam o efeito da maltose na produção de NO e ROS, entretanto é conhecido que as fontes de carbono são freqüentemente relacionadas com a atividade de enzimas antioxidantes (Couée et al., 2006).
Os nossos resultados demonstraram que a adição de maltose ao meio de cultura causou um aumento inicial na produção de NO (Fig. 6A). Após 21 dias de cultivo, a produção de NO foi menor quando comparada com o controle, nas diferentes concentrações testadas (Fig. 5 e 6B). Similarmente ao observado para NO, o conteúdo de ROS, nos tratamentos suplementados com maltose, também foi inferior ao controle após 21 dias de cultivo. Estes resultados sugerem que, algum mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo foi ativado após a suplementação de maltose ao meio de cultura, impedindo que o conteúdo de ROS e NO permanecessem altos.
Alguns trabalhos tem mostrado que a maltose também atua como uma molécula sinalizadora (Couée et al., 2006; Bolouri-Moghaddam et al., 2010). Uma das funções atribuída aos açúcares solúveis é a indução da expressão de enzimas antioxidantes em resposta ao estresse oxidativo (Couée et al., 2006). Açúcares solúveis podem estar envolvidos na via de produção metabólica de ROS, como na respiração, mas também podem estimular a via de produção de NADPH, contribuindo
para a eliminação de ROS, através da ativação das enzimas antioxiantes(Couée et
al., 2006).
A maltose foi usada como fonte de carbono, no cultivo in vitro de Trifolium repens, e o seu efeito na atividade de SOD foi avaliado (Ślesak et al., 2006), uma enzima antioxidante envolvida na regulação do nível de ROS em plantas. Foi demonstrado que os açúcares sacarose, frutose e maltose, aumentaram a atividade da SOD nas culturas de T. repens.
A adição de maltose ao meio de cultura, além de atuar como promotor de maturação, também é importante para a indução de culturas embriogênicas. A
indução da embriogenese somática em Hevea brasiliensis (Blanc et al., 2002) foi uniforme, e duas vezes mais rápida, quando o meio foi suplementado com maltose em substituição à sacarose. Ao final do cultivo, os autores observaram um aumento da atividade de enzimas antioxidantes e proteínas de membrana na presença de maltose, os quais associaram estas respostas com a organização do embrião somático, e com a manutenção da integridade da membrana destes (Blanc et al., 2002).Estudos com essa abordagem, visando quantificar a atividade das enzimas antioxidantes no sistema de culturas embriogênicas de A. angustifolia, poderiam elucidar diferentes aspectos relacionados à produção de NO e ROS durante a maturação.
5.2.3. ABA
Vários estudos indicam a importância do ABA na maturação de embriões somáticos, sendo que a sua adição no meio de maturação promove o desenvolvimento normal dos embriões e a sua conversão em plântulas em várias espécies (Bertossi et al., 2001; Stasolla & Yeung, 2003).
Vários estudos têm mostrado em sistemas vegetais que a adição de ABA resulta no aumento do conteúdo de NO e ROS. Em células-guarda de A. thaliana, foi demonstrado que a adição do ABA ao meio de cultura aumentou os níveis endógenos de ROS e de NO (Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001, Neill et al., 2002; Guo et al., 2003). Adicionalmente, trabalhos tem mostrado que o NO atua como molécula chave na mediação de respostas ao ABA em ervilha (Neill et al., 2002),
Vicia faba (Garcia-Mata & Lamattina, 2002) e A. thaliana (Desikan et al., 2004). Em A. thaliana, Bright et al. (2006) constataram que o ABA induz a formação de NO
dependente do aumento de H2O2. Liu et al. (2009) confirmaram que o aumento de NO é essencial e responsável pela diminuição do conteúdo de ABA em sementes de
A. thaliana, para que ocorra a quebra de dormência.
Comparando-se o período de cultivo, verificou-se que a produção de ROS e NO no meio de cultura suplementado com ABA foi maior no início, durante as primeiras horas de incubação, quando comparada com sua adição após 21 de cultivo. Porém, salienta-se que dentre os promotores de maturação testados, o ABA foi o único que apresentou conteúdo crescente de ROS aos 21 dias de cultivo, enquanto os demais tratamentos permaneceram constantes neste período de avaliação (Fig. 7B). Neste sentido, pode-se sugerir que o ABA apresentou um possível efeito protetor considerando-se os resultados obtidos no presente trabalho.
5.2.4. ABA + PEG + Maltose
A combinação de ABA, PEG e maltose, utilizada nesse experimento objetivando a maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia foram estabelecidas em trabalhos anteriores para essa espécie (dos Santos et al., 2002) e para outras coníferas, como P. taeda (Li et al., 1998). Para A. angustifolia os tratamentos contendo, 9% de PEG e 9% de maltose no meio de cultura, com ou sem adição de ABA, promoveram a maturação dos embriões somáticos (dos Santos et al., 2002), enquanto para P. taeda o meio de maturação, contendo 6% de PEG, 4% de maltose e 150 µM de ABA, induziu a formação de embriões somáticos cotiledonares (Li et al., 1998).
Nossos resultados demonstraram que, a adição conjunta dos três promotores de maturação, foi responsável pela diminuição do conteúdo de NO (Fig. 6, 21 e 22) e ROS (7 e 23) em relação ao controle após 21 dias de cultivo. Durante as primeiras duas horas de incubação das culturas embriogênicas com o meio APM, observou-se um aumento no conteúdo de NO e ROS, que embora menor em relação aos outros meios de cultura, foi maior quando comparado ao mesmo tratamento após 21 d
Observou-se para o tratamento APM, que a transferência das culturas embriogênicas para um novo meio de cultivo de mesma composição, após 21 dias, não causou aumento dos níveis de NO nem diminuição de ROS (Fig. 12). O aumento nestes compostos foi observado somente para o tratamento controle, o que sugere que algum mecanismo de proteção seja ativado durante a maturação, com os promotores incorporados ao meio de cultura. Neste sentido, a análise da atividade de enzimas antioxidantes pode ser um fator chave para elucidar o envolvimento do ABA na produção de NO no processo de maturação de culturas embriogênicas de A.
angustifolia.
Adicionalmente, o tratamento combinando os três promotores de maturação foi mais efeciente na maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia da linhagem MSG, uma vez que resultou na evolução morfogenética destas culturas (Fig. 18), apresentando embriões somáticos em estádios mais avançados de desenvolvimento, concomitantemente a redução do crescimento (Fig. 20) e do conteúdo endógeno de NO e ROS (Figs. 22 e 23).