Hvilke kilder bruker eiendomsutviklerne til å finne informasjon over eiendommene? . 18

3.1 Origem e função

O nome “centrômero” do grego kentron (centro) e meros (parte), foi dado à constricção primária do cromossomo por Darlington em 1936. O centrômero é a região cromossômica que determina a formação do cinetocoro e possibilita a coesão das cromátides irmãs durante a divisão celular. Pelo cinetocoro, o cromossomo interage com as fibras do fuso, possibilitando a segregação cromossômica correta (Villasante e col., 2007). É sabido que um cromossomo sem centrômero embora capaz de se replicar é perdido após uma ou duas divisões celulares (Wagner e col., 1993), eles são, portanto, cruciais para a estabilidade genética, e defeitos na função centromérica foram associados a doenças como câncer e outras síndromes genéticas, como por exemplo, a síndrome ICF (imunodeficiência, instabilidade centromérica e anomalias faciais).

Morfologicamente o centrômero divide o cromossomo em duas partes, chamadas de braços, onde o braço mais curto é denominado de “p” (petit) e o mais longo de “q” (subseqüente a “p”).

Quanto à posição centromérica os cromossomos podem ser classificados como telocêntricos, acrocêntricos, metacêntricos ou submetacêntricos. Nos cromossomos ditos telocêntricos os centrômeros localizam-se em uma das extremidades e não há braço curto. Nos acrocêntricos, o centrômero é localizado próximo a umas das extremidades, nos metacêntricos a localização dessas estruturas é mediana e nos submetacêntricos os centrômeros estão entre o ponto médio e as extremidades (Wagner e col., 1993).

3.2 Estrutura

A cromatina centromérica contém uma sequência única de DNA normalmente não encontrada em outras partes dos cromossomos. Nos eucariotos mais complexos em particular ela é chamada de heterocromatina e contém seqüências relativamente repetitivas de DNA como, por exemplo, GGAAT. Este tipo de DNA pode constituir uma porção significativa do DNA genômico, variando de 20 a 40% do total (Wagner e col., 1993).

Introdução

17 Duas características distinguem os centrômeros do restante do cromossomo: a presença da variante da histona H3, CENP-A e, na maioria dos organismos, a presença de heterocromatina (Pidoux &Allshire, 2005).

Os centrômeros variam em tamanho e complexidade, podendo ser formados por uma pequena sequência (125pb) em levedura, ou por um enorme fragmento de repetições relativamente simples de 250 kb em drosófilas e 5000 kb em humanos (revisto em Choo, 1997). Estruturalmente, eles compreendem uma estrutura de cromatina diferenciada, consistindo em DNA e um complexo protéico chamado cinetocoro.

A sequência de DNA não é conservada entre os centrômeros de diferentes organismos, embora a presença de DNA satélite seja uma característica de praticamente todos os organismos eucarióticos (Pidoux &Allshire, 2005; Amor & Choo, 2002). Esta seqüência consiste em repetições em tandem de 171 pares de bases (monômero), e é rica em AT (Choo, 1997). Estes monômeros são organizados em repetições que variam entre 3 e 5Mb de tamanho e apresentam uma alta similaridade nas seqüências que os compõem (Alkan e col., 2007).

Em camundongos, os centrômeros são compostos por duas classes de seqüências repetitivas de DNA, determinadas satélites major e minor. A seqüência

major é composta por repetições em tandem de um monômero de 234 pares de bases.

Este DNA é encontrado nas regiões pericêntricas e heterocromáticas de todos os cromossomos, com exceção do Y. Além disso, a seqüência de todos os monômeros parece ser conservada em todos os cromossomos, e este alto grau de conservação sugere freqüentes recombinações entre cromossomos não homólogos, que ainda parece ser facilitada pela natureza acrocêntrica dos cromossomos murinos (Choo, 1997).

Seqüências minor são encontradas com uma freqüência 10 a 20 vezes menor

que as seqüências major. Estas seqüências são compostas de unidades básicas de 120pb organizadas em repetições de aproximadamente 300Kb, ou aproximadamente 2500 cópias por cromossomo (Choo, 1997). Deste modo, parece que a sequência exata de DNA não é importante para a formação de um centrômero functional e, cada vez mais, a atividade centromérica parece estar relacionada à organização da cromatina que seria centrômero-específica (Choo, 1998).

A cromatina centromérica pode ser dividida em core cromatina centromérica, que é o sítio de montagem do complexo cinetocoro, e em cromatina pericêntrica, que

está particularmente associada com a formação da “heterocromatina”, e que é vital para a integridade estrutural do centrômero (Amor e col, 2004). Também tem sido proposto que a heterocromatina pericêntrica pode prover uma barreira física entre os centrômeros e os braços eucromáticos dos cromossomos, e assim suprimir a recombinação meiótica. No entanto, a função da heterocromatina que parece mais essencial para a função centromérica é sua habilidade intrínseca de recrutar o complexo coesivo para as regiões centroméricas. A presença da heterocromatina nos centrômeros capacita o enriquecimento da coesão nestes sítios e sua manutenção até a separação das cromátides irmãs (Amor e col, 2004; Pidoux &Allshire, 2000)

A região de heterocromatina centromérica é também uma região de silenciamento transcricional. Genes localizados nesta região estão silenciados. Este fenômeno foi inicialmente descrito em drosófilas, e tem sido identificado em diversos organismos, de leveduras a humanos (Pidoux & Allshire, 2005).

3.3 Evolução centromérica, especiação, anormalidades estruturais e câncer.

O centrômero contribui para a especiação. Em camundongos, a especiação é comumente alcançada pela presença de cromossomos telocêntricos que apresentam uma alta taxa de homogenização. Existe uma identidade maior que 99% entre as seqüências telocêntricas de todos os cromossomos de camundongos, o que leva a freqüentes recombinações e a uma manutenção evolucionária estável. Esta similaridade genética, contudo, também possibilita a formação de translocações Robertsonianas (Rob) (Kalitsis e col., 2006; Garagna e col., 2001). Este tipo de translocação foi primeiro descrito em 1916 em gafanhotos por W. R. B. Robertson (revisto em Gardner & Sutherland, 2004). Camundongos com translocações Rob existem na natureza (Gazave e col., 2003; Nachman & Searle, 1995) e estas translocações são também comuns em camundongos de laboratório. Na natureza, os camundongos que carregam cromossomos com translocaçãoes Rob apresentam fertilidade reduzida (Merico e col., 2003; Bidau e col., 2001).

Fusões terminais de cromossomos humanos acrocêntricos geram translocações Robertsonianas. Estas translocações constituem a mais comum anormalidade genética em fetos abortados e recém nascidos (Kim and Shaffer, 2002; Nielsen and Wohlert,

Introdução

19 1991; Jacobs, 1981). Contudo, translocações Rob também têm sido encontradas em lesões genéticas adquiridas ou constitutivas como cânceres hematológicos (Welborn, 2004; Qian e col., 2002), tumores sólidos (Bayani e col., 2003; Padilla-Nash e col., 2001), em leucemia mielóide aguda (Shimokawa e col., 2004)

A posição espacial dos centrômeros no núcleo interfásico pode ser um fator que aumenta a propensão ao rearranjo (Guffei e col. 2007, Louis e col., 2005). Além disso, a homologia entre as seqüências centroméricas dos diferentes cromossomos pode também ter um papel na freqüência elevada de translocações nestas regiões (Bayani e col, 2006). Rearranjos estruturais em osteosarcomas mostram que quase 30% dos pontos de quebra acontecem nas regiões pericentroméricas (Bayani, 2003). Da mesma maneira, estudos em tumores de próstata mostram uma alta freqüência de quebras em regiões centroméricas e pericentroméricas (Vukovic e col., 2007; Beheshti e col., 2000). O freqüente envolvimento de regiões centroméricas na instabilidade genômica em câncer é também discutida por Bayanni e colaboradores em uma revisão recente (2007).

As células tumorais parecem seguir princípios evolucionários durante o processo de transformação maligna. Portanto, não é surpreendente que regiões pericentroméricas sejam hotspots tanto para recombinação durante a evolução (Yue e col., 2005) quanto ao longo da transformação maligna (Jamet e col., 2005; Shaw and Lupski, 2004).

3.4 Organização nuclear dos centrômeros no núcleo interfásico.

3.4.1 – Ciclo celular

A organização tridimensional (3D) dos centrômeros no núcleo interfásico tem sido estudada no contexto da diferenciação celular, ciclo celular, desenvolvimento embrionário e transformação celular. Estudando fibroblastos diplóides humanos, Bartholdi (1991) descreveu que a posição dos centrômeros varia durante o ciclo celular. Em G1, os centrômeros estariam associados com o nucléolo ou fusionados em cromocentros, com poucos centrômeros sozinhos. Na fase S, os centrômeros fusionados se dispersariam e formariam padrões distintos (anéis ou linhas). Na prófase, os centrômeros estariam condensados em pontos duplos distintos.

A análise de linfócitos humanos (Weimer e col., 1992) também indica uma organização ciclo celular-específica dos centrômeros no núcleo interfásico. Usando anticorpos contra sequências centroméricas (ACAS) de pacientes com síndrome de CREST, estes autores descreveram um posicionamento periférico dos centrômeros em G0 e G1. Em G2, as células apresentavam uma distribuição randômica dos centrômeros.

Sarkar e colaboradores (2007) descreveram a organização 3D de centrômeros em linfócitos de camundongos durante o ciclo celular. Eles também mostraram que a localização centromérica no núcleo é dependente do ciclo celular. Os centrômeros foram encontrados principalmente nas regiões periféricas nas fases G1 e G2 e uma distribuição mais dispersa no núcleo foi encontrada durante o crescimento logarítmico.

Os dados apresentados acima sugerem que os centrômeros são distribuídos no núcleo de forma dependente de ciclo celular em todas as células humanas e murinas examinadas até agora.

3.4.2 – Diferenciação celular

Beil e colaboradores (2005 e 2002) estudaram a organização dos centrômeros durante a diferenciação da linhagem celular de leucemia NB4. A indução da diferenciação por ácido retinóico em células NB4 induziu uma distribuição nuclear alternativa de centrômeros quando comparado com células não diferenciadas. As células diferenciadas apresentaram diminuição no número de clusters centroméricos (cromocentros) e a distância entre eles aumentou de 350 para 800nm.

Células T murinas diferenciadas apresentam organização centromérica diferenciada quando comparadas a células não diferenciadas (Kim e col., 2004). Enquanto as células indiferenciadas tinham seus centrômeros localizados no interior nuclear, as células diferenciadas (CD4+ e CD8+) tinham seus centrômeros posicionados mais perifericamente. Similarmente, células tronco embrionárias humanas têm uma pequena porção de seus centrômeros localizados na periferia nuclear quando comparadas com as células já diferenciadas (Wiblin e col., 2005).

Desta forma, é possível que a diferenciação celular necessite de alterações das posições centroméricas no núcleo e que estas estejam relacionadas ao remodelamento global das funções nucleares durante este processo, tais como, mudanças na transcrição gênica e parada da replicação. A periferia nuclear parece ser a região

Introdução

21 preferencial dos centrômeros quando as células se diferenciam e é também a posição preferida dos centrômeros em G0 e G1.

3.4.3 – Transformação maligna

O reposicionamento centromérico no núcleo interfásico contribui também para o remodelamento do núcleo na transformação maligna. Há um significativo remodelamento das posições centroméricas no núcleo de linfócitos transformados quando comparados aos normais (Sarkar e col., 2007). Enquanto os centrômeros dos linfócitos normais de camundongo assumem uma posição periférica no núcleo interfásico, os das células tumorais se redistribuem em uma posição nuclear mais central (Guffei e col., 2007). O remodelamento das posições centroméricas permite também o desenvolvimento de translocações Robertsonianas nos núcleus das células murinas depois da ativação condicional de c-Myc (Guffei e col., 2007). O mesmo rearranjo é também observado em células com expressão constitutiva de c-Myc (Guffei e col., 2007; McCormack e col., 1998).

Os centrômeros e suas regiões pericêntricas são evolucionariamente dinâmicas. Estas características reforçam a hipótese de que centrômeros reposicionados espacialmente podem então interagir entre eles permitindo aumento de eventos de recombinação quebra e fusão. Portanto, o remodelamento dos centrômeros durante a transformação celular pode permitir a ocorrência de rearranjos cromossômicos e favorecer a expressão de novos genes e novos padrões de replicação, uma vez que estes estão mais freqüentemente localizados no interior nuclear, região associada tanto com replicação quanto transcrição (Lanctôt e col., 2007; Casolari e col., 2005).