Com finalidade de investigar agentes quimioterápicos anti-HPV em potencial foram avaliadas a citotoxicidade de diversas concentrações de frações de M. zehntneri frente a células eucarióticas C33a (não infectadas) e HeLa (infectadas), conforme ilustradas nas Figuras 34 e 35.
100 ± 4,4 88,1 ± 5,9 94,2 ± 4,4 101,3 ± 33,7 99,9 ±17,7 72,6 ± 6,9 19,27 ± 1,3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V ia bi li da de c elu la r (% ) 100 ± 1,1 87,8 ± 6,2 95,1 ± 5,5 87,6 ± 9,7 86,3 ± 1,3 109,6 ± 18,1 19,5 ± 1,3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V ia bi li da de c elu la r (% ) 100 ± 4,4 96,6± 3,2 92,7 ± 2 97,6 ± 6,2 94,8 ± 7 76,3 ± 10,1 19,3 ± 1,3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V ia bi li da de c elu la r (% )
– Porcentagem de células viáveis na linhagem C33A tratadas com diferentes concentrações de frações clorofórmicas pH 1 (A) e butanólicas pH 10 (C) obtidas a partir de partes aéreas e diferentes concentrações de frações clorofórmicas pH 1 (B) e butanólicas pH 10 (D) obtidas a partir de raízes.
A B
93 100 ± 0,8 85,3 ± 1,9 64,3 ± 1,2 69,3 ± 1,6 93,5 ± 1,2 83,1 ± 3,5 54,1 ± 0,47 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V ia bi li da de c elu la r (% ) 100 ± 6,4 114,4 ± 23,8 100 ± 14,7 100 ± 6,5 104,7 ± 24,0 100 ± 10,6 60,2 ± 3,7 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V ia bi li da de c elu la r (% ) A B C D Figura 35 – Porcentagem de células viáveis na linhagem HeLa tratadas com diferentes concentrações de frações clorofórmicas pH 1 (A) e butanólicas pH 10 (C) obtidas a partir de partes aéreas e diferentes concentrações de frações clorofórmicas pH 1 (B) e butanólica (D).
Para linhagem C33a tratada com a fração clorofórmica ácida obtida de partes aéreas (Figura 34, A) foram observadas ações citotóxicas nas concentrações de 12,5 μg/mL (7,3 ± 2,0%) e 100 μg/mL (23,7 ± 10,1%) em relação ao controle de veículo (DMSO). Quando a linhagem C33a foi tratada com a fração clorofórmica ácida obtida de raízes (Figura 34, B) foi observado que as concentrações de 6,25 μg/mL (11,9 ± 5,9%) e 100 μg/mL (27,4 ± 6,9%) resultaram em um aumento da citotoxicidade em relação ao veículo.
Por outro lado, quando a linhagem C33a foi tratada com diferentes concentrações de fração butanólica básica obtidas de partes aéreas do material vegetal (Figura 34, C) foi observado citotoxicidade nas concentrações de 6,25 μg/mL (17,8 ± 4,4%), 12,5 μg/mL (68,3 ± 15,2%), 50 μg/mL (16.3 ± 7,4%) e 100 μg/mL (3,4 ±1,8%). Essa mesma linhagem ao ser tratada com diferentes concentrações de frações butanólicas básica obtidas de raízes (Figura 34, D) foi observado citotoxicidade nas concentrações de 6,25 μg/mL (12,2 ± 6,2%), 25 μg/mL (12,4 ± 9,7%) e 50 μg/mL (13,7 ± 1,3%).
A partir dos resultados desse experimento sugere-se que há componente(s) bioativo(s) de ação citotóxica contra linhagem de células C33a em raízes e partes aéreas de M. zehntneri. Ainda, as ações citotóxicas observada nas frações clorofórmica e butanólica indicam que possivelmente há mais de um composto na planta com ação citotóxica para essa linhagem.
Para linhagem HeLa tratada com a fração clorofórmica ácida obtida de partes aéreas (Figura 35, A) foram observadas ações citotóxicas nas concentrações de 6,25 μg/mL (14,7 ± 1,9%), 12,5 μg/mL (35,7 ± 1,2%), 25 μg/mL (30,7 ± 1,6%), 50 μg/mL (6,5 ± 1,2%) e 100 μg/mL (16,9 ± 3,5%) em relação ao controle de veículo (DMSO), sendo as concentrações de 12,5 μg/mL e 25 μg/mL de ação citotóxica próximas à cisplatina (CISP). Quando a mesma linhagem é tratada com a fração clorofórmica ácida obtida de raízes observa-se ação citotóxica apenas na concentração de 25 μg/mL (Figura 35, B) com viabilidade celular próxima ao observado na cisplatina. A linhagem HeLa quando tratada com as frações butanólicas obtidas de partes aéreas (Figura 35, C) e raízes (Figura 35, D) não apresentaram ações citotóxicas.
Nesse contexto, os resultados sugerem que há componente(s) bioativo(s) de ação citotóxica contra linhagem de células HeLa em frações clorofórmicas ácidas obtidas de partes aéreas e raízes. Por outro lado, componentes presentes na fração butanólica não foram capazes de induzir a morte celular na linhagem HeLa nessas concentrações, o que abre a necessidade de realizar testes em concentrações maiores para que possa certificar que essas frações não possuem tal atividade.
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Malek e colaboradores (2008) investigaram em Pereskia bleo o efeito citotóxico do extrato metanólico (que partiram de partes aéreas) e suas frações resultantes (hexano, acetato de etila e água) em diferentes linhagens de células de carcinomas. O extrato metanólico demonstrou alguma atividade citotóxica em linhagem de células de carcinomas cervical, mama, cólon de útero e nasofaríngeo.
Zou e colaboradores (2005) ao realizarem estudos experimentais in vitro com extrato aquoso do fruto de Opuntia spp. observaram um significativo aumento na apoptose e inibição do crescimento em linhagem de HeLa, assim como em linhagem de carcinoma ovariano. Ainda para esse gênero, Liang e colaboradores (2008) realizaram experimentos in vivo com extrato do fruto e atribuíram aos polissacarídeos à atividade antitumoral contra linhagem de células infectadas por HPV.
Hanm e colaboradores (2015) avaliaram a atividade anti-HPV em linhagem HeLa de extrato metanólico e suas frações (hexano e acetato de etila) que partiram de raízes, tronco, frutos e sementes de Opuntia humifusa. Os resultados desse estudo sugerem que a fração hexano preparadas a partir de sementes e as frações acetato de etila preparadas a partir de frutos, troncos e raízes inibiram a proliferação celular por meio da interrupção da fase G1 do ciclo celular em linhagem HeLa. Ainda, observaram que a fração acetato de etila preparadas a partir de sementes induziu a proliferação dessa linhagem.
Portanto, ao considerar a relação quimiotaxonômica entre espécies pertencentes à família Cactaceae, sugere-se que possivelmente os mesmos componentes bioativos responsáveis pela ação anticâncer também estão presentes em M. zehntneri e envolvidos na ação citotóxica frente às linhagens C33a e HeLa. Entretanto, estudos mais aprofundados são necessários para saber quais os metabólitos envolvidos e como eles atuam na ação anticâncer. Além disso, há a possibilidade dos componentes presentes no extrato atuarem de forma sinérgica para potencializar a ação citotóxica. Apesar disso, acredita-se que esses resultados agregam valor científico à espécie e auxiliarão no desenvolvimento de política pública de preservação.
CONCLUSÕES
O uso da CCD e reativo de Dragendorff não foi satisfatório para análise comparativa de alguns extratos, possivelmente atribuída ao baixo rendimento do metabólito secundário em questão, a interação desse com outros metabólitos na amostra mascarando o resultado positivo e a interação entre os reativos de Dragendorff e o 1- butil-3-metilimidazolio:BF4 (LI) que pode induzir um resultado negativo. Ainda, essa técnica possibilitou sugerir a presença de um mesmo alcaloide em amostras obtidas por diferentes técnicas de extração e que partiram de partes aéreas e raízes.
A pesagem associada à espectrofotometria por ultravioleta é fundamental na comparação de condições em cada uma das técnicas de extração. Por meio dessas avaliações foi possível escolher uma amostra representativa para maceração, EAU com etanol 95%, EAU com LI e EFS.
A aplicação de metodologia em CLAE-DAD contribuiu na análise quantitativa e qualitativa, bem como na comparação de cromatogramas de diferentes amostras que partiram de partes aéreas de M. zehntneri. Ademais, a varredura por DAD possibilitou a visualização de espectros dos picos majoritários. Essa informação mais a investigação de espectros de alcaloides na família Cactaceae permitiu prever os possíveis alcaloides presentes nas amostras.
Os resultados encontrados para diferentes técnicas de extração sugerem que o sistema solvente foi o principal fator determinante no perfil de metabólito no extrato. As técnicas de extrações bem como as diferentes condições em mesmo sistema solvente ofereceram diferenças quantitativas, porém diferenças qualitativas não foram observadas;
Na análise comparativa de amostras que partiram de partes aéreas de indivíduos jovens e adultos submetidas à técnica de EFS foi demonstrado por meio do rendimento global bem como por cromatogramas em 254 nm e 279 nm que a melhor condição operacional para extração de alcaloides é de 300 bar/35 ºC.
Ainda para EFS, as amostras que partiram de partes aéreas de indivíduos adultos apresentam em maior quantidade os compostos majoritários de tR 17,8 e 20,2 minutos quando comparadas às amostras que partiram de partes aéreas de indivíduos jovens. Ainda, a análise dos resultados nessa etapa do estudo indica que as diferentes
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condições ofereceram diferenças quantitativas para os compostos majoritários; por outro lado, diferenças qualitativas não foram observadas.
Para amostras pool submetidas às diferentes condições de EFS foi observado que a pressão de 200 bar e 300 bar ofereceram uma extração seletiva de substâncias cujas absorbâncias são máximas nas proximidades de 279 nm.
Os perfis cromatográficos sugerem que as técnicas de maceração, EAU – etanol 95% e EAU – líquido iônico possuem semelhanças qualitativas, por conseguinte, ofereceram o mesmo rol de metabólitos. Dentre as técnicas de extração clássicas e não-clássicas a EFS foi a mais seletiva na extração de possíveis alcaloides, posto que extraiu um maior número e quantidade de metabólitos com características de absorbâncias em 254 nm e 279 nm.
Ao considerar a relação quimiotaxonômica entre espécies pertencentes à família Cactaceae e os resultados para as linhagens C33a e HeLa sugeremos que há potencial na espécie para ação citotóxica.
A aplicação de técnicas sustentáveis e os resultados experimentais apresentados no trabalho agregaram valor científico para a espécie de Melocactus zehntneri. Assim, espera-se que essa contribuição auxilie no desenvolvimento de políticas públicas para preservação dessa espécie e valorização do bioma Caatinga.
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