Animais
Foram utilizadas ratas Wistar virgens, em idade reprodutiva (três meses), pesando aproximadamente 220g, e ratos Wistar pesando em torno de 250g. Os animais foram adquiridos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB – Unicamp, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil) e adaptados no Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp.
Seqüência Experimental
Geração F0
Período de Diabetogênese - Indução do diabete grave
O diabete foi induzido por streptozotocin (STZ – SIGMA Chemical Company, St. Louis, Millstone, EUA). STZ foi dissolvido em tampão citrato (0,1M, pH 4,5) e administrado via intravenosa na dose de 40 mg/kg de peso corpóreo em ratas com 90 dias de vida (fase adulta) que constituíram o grupo diabético (Geração F0). As ratas não-diabéticas receberam somente o
veículo (tampão citrato). A glicemia foi avaliada sete dias após a administração do STZ com uso de glicosímetro convencional One-Touch Ultra (LifeScan, Johnson and Johnson£
, Milpitas, Califórnia, EUA), que expressa o valor em miligramas por decilitro (mg/dL). Foi considerada glicemia normal até o limite de 120 mg/dL para fêmeas que receberam somente o veículo. O estado de diabete grave (DG) foi confirmado quando a glicemia das ratas que receberam o STZ foi superior a 300 mg/dL (31, 41, 17).
Período de Acasalamento
Após o período de diabetogênese, foi iniciada a fase de acasalamento com duração máxima de 15 dias, que envolve pelo menos três ciclos estrais. As ratas foram colocadas na presença de um rato macho não-diabético durante o período noturno. Na manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais das fêmeas foram colhidos para análise em microscópio de luz. O dia zero de prenhez foi considerado a partir da identificação de espermatozóides na lâmina (12, 11). As ratas que não acasalaram neste período foram consideradas inférteis (12) e foram mortas por anestesia com tiopental sódico (Thiopentax£
Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda., São Paulo, Brasil) na dose de 50 mg/kg de peso corpóreo.
Período de Prenhez
Durante a prenhez e a lactação, tanto as ratas não-diabéticas quanto as diabéticas foram mantidas em gaiolas individuais. Nas tardes dos dias 0 e 20 de prenhez, foram verificados os pesos corpóreos e foram colhidas amostras de sangue da cauda para determinação da glicemia materna por glicosímetro convencional para confirmação do diabete grave. Após o período de amamentação da prole, as ratas da geração F0 foram mortas por anestesia com tiopental sódico
(Thiopentax£
- 50 mg/kg).
Geração F1
Obtenção da Geração F1
Os recém-nascidos (RN) foram obtidos por parto vaginal a partir da Geração F0. Após o
nascimento, os RN foram pesados e foi realizada sexagem dos mesmos. Os RN fêmeas (F1) foram
mantidos na presença da mãe para amamentação durante 21 dias, com número máximo de oito fêmeas, correspondentes aos oito tetos de cada mãe, para que a distribuição alimentar materna fosse equivalente para toda prole (8).
Classificação dos pesos corpóreos dos RN F1
Para a classificação dos pesos dos RN, foi realizada a análise de acordo com a média ± 1,0 x desvio-padrão (DP) dos pesos corporais obtidos do grupo controle, que determinou três classes diferentes de RN dentro dos grupos estudados: pequeno para idade de prenhez (PIP), cujo peso foi inferior a média -1,0 x DP; adequado para idade de prenhez (AIP), cujo peso foi compreendido entre a média ± 1,0 x DP e grande para a idade de prenhez (GIP), cujo o peso foi maior que a média +1,0 x DP (7).
Período Pós-desmame e Acasalamento
No 22o dia de vida pós-natal (equivalente ao 1o dia de desmame), as ratas F1 foram
separadas de suas mães e mantidas até a fase adulta. Durante este período, glicemia e peso corpóreo foram determinados a cada 30 dias para investigar o período de aparecimento de possível hiperglicemia. Na fase adulta (em torno do 90o dia de vida), todas as ratas da geração F1
foram submetidas ao acasalamento com ratos Wistar machos não-diabéticos (41, 17), conforme procedimento realizado com as ratas da geração F0.
Período de Prenhez
Durante a prenhez, as fêmeas foram mantidas em gaiolas individuais e distribuídas nos grupo experimentais (n mínimo = 12 ratas com prenhez a termo com filhotes).
Intervenção: Prática do exercício físico (Natação)
Uma semana antes do início da prática do exercício físico, as ratas dos grupos exercitados (PIP e AIP) foram colocadas diariamente em tanques de cimento (100 cm de comprimento x 70 cm de largura x 60 cm de profundidade), contendo nível máximo de 10 cm de água aquecida à temperatura de 31ºC durante 15 minutos. Este procedimento permitiu a adaptação dos animais ao meio líquido, sem proporcionar condicionamento físico. O programa de natação, desenvolvido para a prática de exercício de intensidade moderada, seguiu a padronização de Volpato et al. (39) (Figura 1). A partir do 7º dia de prenhez (pós-implantação embrionária), as ratas AIP e PIP foram submetidas à prática da natação, enquanto as ratas dos grupos não exercitados AIP e PIP permaneceram em volume similar de água ao utilizado no período de adaptação. Para a prática da natação, o volume de água no tanque foi de 40 cm de água a 31ºC, nível suficiente para que sejam estimuladas a nadar, sem sobrecarga adicional ao corpo. Esta atividade foi praticada diariamente em horário fixo durante seis dias por semana, com descanso aos domingos. A duração inicial foi de 20 minutos, com aumento progressivo de 10 minutos por dia até o máximo de 60 minutos, este tempo foi mantido até o 20º dia prenhez.
Grupos experimentais
Os grupos experimentais foram distribuídos da seguinte forma: AIP não exercitado - ratas prenhes não submetidas ao exercício físico (AIP NE); AIP exercitado a partir do 7º dia de prenhez - ratas submetidas ao exercício físico iniciado a partir do 7º dia de prenhez (AIP E); PIP não exercitado - ratas prenhes não submetidas ao exercício físico (PIP NE); PIP exercitado a partir do dia sete de prenhez - ratas submetidas ao exercício físico iniciado a partir do 7º dia de prenhez (PIP E).
Teste Oral de Tolerância à Glicose (TTG)
No 17o dia de prenhez, foi realizado o TTG para avaliação do desenvolvimento de alterações do metabolismo glicêmico, um marcador empregado rotineiramente na clínica, de acordo com o protocolo clínico para diagnóstico do diabete. Após seis horas de jejum, foi coletada uma gota de sangue por punção venosa na cauda das ratas para determinação glicêmica (tempo 0). Logo após, as ratas receberam solução de glicose (0,2 g/mL) via intragástrica (gavage) na dose de 2,0 g/kg de peso corpóreo. Decorridos 10, 20, 30 e 120 minutos após a administração da solução de glicose, foram determinadas as glicemias (25) estas medidas também foram avaliadas pela estimativa da área total sob a curva usando matematicamente o método trapezoidal (37).
Determinações glicêmicas, peso materno, perfil lipídico e dosagem de lactato
Nas tardes dos dias 0, 7, 14 e 20 de prenhez, os animais foram pesados e foram realizadas determinações glicêmicas utilizando glicosímetro convencional. Nas tardes dos dias 0, 14 e 20 de prenhez, foram colhidas amostras de sangue das caudas das ratas para avaliação do perfil lipídico (Accutrend® Plus, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A determinação de lactato (Accutrend® Plus) foi realizada nos dias 0 e 20º de prenhez, pois como o exercício é considerado de intensidade leve a moderada foram realizadas essas medidas para confirmação de que o exercício foi aeróbio (com gasto de oxigênio).
No caso de ausência de ganho de peso corpóreo compatível para idade de prenhez, as ratas foram submetidas ao procedimento anestésico com excesso de gás carbônico. Em seguida, o útero foi colocado em sulfeto de amônio e outros reagentes (reativo de Salewski) para coloração dos possíveis pontos de implantação (32).
Período de lactação
Foi verificado o peso corpóreo e as glicemias das ratas no período de lactação na manhã do 10º dia.
Procedimentos do 10º dia de lactação – coleta de sangue e soro
As ratas da geração F1 foram anestesiadas com tiopental sódico (Thiopentax® - 50mg/kg
de peso corpóreo) no décimo dia de lactação. Foi realizado o dessangramento das ratas para obtenção de amostras de sangue para dosagem de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e de triglicérides e obtenção de soro para dosagens de hormônios sexuais, 17-β estradiol e progesterona por quimiluminescência (Immulite®, Siemens Healthcare Diagnostics
Incorporation, Tarrytown, Nova Iorque, EUA).
Análise estatística
Os resultados foram apresentados como media ± desvio padrão. Os pesos corpóreos, glicemia e 17β-estradiol foram analisados por ANOVA seguido pelo Teste de Comparações Múltiplas de Tukey. Para os dados de desempenho reprodutivo (porcentagem de ratas que nasceram com peso adequado, pequeno e grande para idade de prenhez, número de ratas com diagnóstico positivo de prenhez, taxa de ratas com prenhez a termo e com perdas embrionárias) foi utilizado o Teste Exato de Fisher. Quando os dados não se ajustaram a uma distribuição normal, foi aplicada Distribuição Gama para análise das concentrações de lipoproteína de alta- densidade (HDL-colesterol), triglicérides, lactato e de progesterona. P<0,05 foi considerado como significância estatística.
RESULTADOS
A tabela 1 mostra os dados de desempenho reprodutivo. As ratas não diabéticas (Geração F0) apresentaram maior porcentagem (p<0,05) de recém-nascidos (RN) com peso
adequado (AIP) e menor taxa (p<0,05) de RN pequenos (PIP) e grandes (GIP) para idade de prenhez. No grupo diabete grave, foi observada porcentagem aumentada (p<0,05) de RN PIP em relação aos que nasceram AIP e GIP (p<0,05). A comparação entre os grupos com diabete grave e não-diabético mostrou que as ratas diabéticas apresentaram menor taxa (p<0,05) de RN AIP e maior porcentagem (p<0,05) PIP em relação às porcentagens do grupo não-diabético. Com relação à geração F1, do total de ratas que nasceram AIP e PIP, a tabela 1 mostra apenas o
número de ratas AIP (n=31) e PIP (n=38) utilizadas no experimento. Das 31 ratas AIP acasaladas, 85,7% tiveram prenhez a termo com filhotes vivos e 14,3% apresentaram perdas embrionárias sem a presença de filhotes vivos no grupo AIP sem exercício físico (AIP NE). No grupo AIP com exercício (AIP E), 76,2% e 23,8% das ratas tiveram filhotes e apresentaram mortes embrionárias, respectivamente. No grupo PIP NE, 55,6% das ratas tinham filhotes e 44,4% delas apresentaram perdas embrionárias. No grupo PIP E, as taxas foram de 65,0% e 35,0%, respectivamente, com relação às mesmas variáveis. Todas essas comparações não diferiram estatisticamente (p>0,05) entre os grupos.
Em relação à comparação entre os diferentes períodos da prenhez independentemente do grupo experimental (AIP ou PIP), praticantes ou não de exercícios físico, cada grupo apresentou aumento significativo (p<0,05) de peso corpóreo gradativamente comparando os dias 0, 7, 14, e 20 de prenhez. Além disso, o grupo AIP E não apresentou diferença estatisticamente significativa em relação ao seu respectivo controle (AIP NE). O mesmo foi verificado entre os grupos PIP E e PIP NE (p>0,05). O grupo PIP NE apresentou médias de peso corpóreo menores no dia zero e 14 de prenhez comparadas às do grupo AIP NE. Nos dias 0 e 7 de prenhez, as médias de peso corpóreo do grupo PIP E foram menores (p<0,05) em relação às do grupo AIP E (Tabela 2).
Em relação ao estudo glicêmico destes animais, os diferentes grupos experimentais (AIP ou PIP, submetidos ou não à prática de exercício físico) apresentaram médias glicêmicas menores (p<0,05) no 14º e 20º dias de prenhez. No dia 0 de prenhez, ratas AIP E apresentaram média glicêmica maior (p<0,05) e menor no 14º dia prenhez (p<0,05) em relação às do grupo AIP NE. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos PIP E e PIP NE, PIP NE e AIP NE e entre PIP E e AIP E (Tabela 2). Os níveis de triglicérides não apresentaram diferenças significativas entre os grupos experimentais com exceção do grupo AIP E, apresentando redução na concentração sérica desta variável no 14º dia de prenhez em relação ao grupo AIP NE. Também foi verificada redução (p<0,05) no grupo PIP E no 14º dia de prenhez em relação ao dia 0. A Tabela 2 também apresenta os resultados da concentração de lactato, mostrando que apenas o grupo PIP E apresentou redução (p<0,05) no dia 20 de prenhez em relação ao dia 0.
O peso corpóreo, glicemia, níveis de progesterona, 17 β-estradiol e de HDL-colesterol no 10º dia de lactação não diferiram (p>0,05) entre os diferentes grupos experimentais, exceto no nível de triglicérides, que foi aumentado (p<0,05) no grupo PIP NE comparado ao do grupo AIP NE (Tabela 3).
DISCUSSÃO
As ratas diabéticas da primeira geração (F0) apresentaram alta porcentagem de recém-
nascidos (RN) classificados como pequenos para idade de prenhez (PIP), decorrente da restrição de crescimento intrauterino (RCIU) causada pela hiperglicemia. Já as ratas não-diabéticas apresentaram uma distribuição normal dos pesos corpóreos dos descendentes, i. e., baixa porcentagem de RN PIP e GIP e maior porcentagem de RN classificados como adequados para idade de prenhez (AIP). Do desmame até o período de prenhez, as ratas PIP ganharam peso corpóreo, mas não atingiram pesos similares aos das ratas que nasceram com peso adequado (dados não mostrados).
No presente estudo, foi verificado que, no dia da confirmação da prenhez (dia 0), as ratas que nasceram com RCIU, independentemente de serem submetidas ao exercício (PIP E) ou não (PIP NE), iniciaram o experimento com pesos corpóreos menores em relação aos pesos das ratas AIP. Essas ratas quando submetidas à natação (AIP E) não apresentaram alterações em relação aos pesos das ratas não submetidas ao exercício físico (AIP NE) ao longo da prenhez. Prazeres et al. (29) verificaram que ratas desnutridas que praticaram natação de forma similar à nossa metodologia apresentaram redução de pesos corpóreos, mostrando efeitos negativos do exercício. Em 2011, Rosa et al. (30) verificaram que ratas que praticaram exercícios voluntários (escalada em torre e subida em postura bípede) durante a prenhez tiveram redução de peso. Nossos resultados, entretanto, mostraram que todas as ratas (AIP e PIP) adquiriram aumento de peso corpóreo durante toda a prenhez, mostrando que a natação (classificada de intensidade moderada, iniciada no 7º dia de prenhez com duração inicial de 20 minutos e com aumento progressivo de 10 minutos por dia até o máximo de 60 minutos, até o 20º dia prenhez) não causou prejuízo no ganho de peso corpóreo. Volpato et al. (40) também verificaram efeitos benéficos da natação em ratas com diabete de intensidade grave (glicemia superior a 300 mg/dL). Uriu-Hare et al. (38) demonstraram que ratas com diabete grave, submetidas à esteira motorizada (16,1 m/min, 45 min/dia), três semanas antes do acasalamento e durante a prenhez, apresentaram ganho de peso corpóreo ao longo da prenhez, diferente dos outros artigos que mostram redução de peso frente ao exercício físico.
As ratas AIP e PIP, independentemente da presença da natação, não apresentaram alterações glicêmicas (hipoglicemia ou hiperglicemia) ao longo da prenhez. Além disso, foi verificado que, de forma geral, houve redução da glicemia a partir do 14º dia prenhez em função
da demanda metabólica aumentada do feto, o qual necessita de maior aporte de nutrientes no período fetal para seu crescimento. Além disso, as ratas AIP e PIP submetidas à natação não apresentaram hipoglicemia, como verificado em um estudo clínico com mulheres diabéticas submetidas a três ou quatro sessões de caminhada por semana iniciando com 25 minutos de exercício com aumento de dois minutos a cada semana até alcançar 40 minutos, sendo esse tempo mantido até o parto. Enfatizando que o exercício foi prejudicial quando aplicado durante a gestação (13). Carlson et al. (9) verificaram que ratas submetidas à esteira (60 min., 12 m/min com 0% de inclinação e mortas no dia 20,5 de prenhez ou 16 m/min a 10% de inclinação para ratas mortas no dia 21,5 de prenhez) apresentaram valores de glicose sanguínea, glucagon e insulina constantes durante o exercício.
No 14º dia de prenhez, os grupos AIP E e PIP E apresentaram redução nas concentrações de triglicérides após sete dias da prática do exercício. Embora a fisiologia do exercício utilize o glicogênio como substrato energético, a síntese lipídica pode alterar a deposição de carboidratos nos estoques de glicogênio, alterando o perfil geral de triglicerídios (22) Os resultados deste estudo corroboram com Volpato et al. (39) que submeteram ratas com diabete grave ao mesmo programa de natação e observaram que o exercício diminuiu os níveis de triglicérides. Mostrando que a influência do exercício físico neste parâmetro foi benéfica. Esse fato pode ser decorrente do aumento da necessidade de energia para a natação (4). Para isso o organismo utiliza a reserva energética de triglicérides a partir do 14º dia de prenhez (período catabólico), ocorrendo a mobilização desses estoques, onde esses triglicérides se ligam a porção lipídica das lipoproteínas, são hidrolisados em ácidos graxos e glicerol pela lipoproteína lipase e transportado para o interior do tecido muscular e adiposo, sendo utilizado como fonte de energia (20, 2). A diminuição das taxas de triglicerídeos encontrada no 14º. dia de prenhez do grupo PIP E em relação ao dia zero pode estar relacionada com a utilização do organismo materno no preparo da síntese bioquímica do leite materno, em que as taxas lipídicas são mobilizadas para sua síntese (5).
A intensidade do exercício é baseada na avaliação do consumo máximo de oxigênio (VO2máx), mas existe dificuldade para aquisição de aparelhos específicos para esta avaliação em
animais de laboratório. Assim, uma forma indireta utilizada é a dosagem de lactato sanguíneo (43, 14, 6, 35). Nossos resultados mostraram diminuição dos níveis de lactato no grupo PIP E no 20º dia de prenhez após 14 dias de natação. Este achado pode ser explicado pelo fato de que esses animais poderiam apresentar um aumento no limiar anaeróbio, i. e., os animais
submetidos ao exercício de intensidade moderada são mais adaptados a esta situação não levando ao aumento no nível de lactato. O excesso de lactato leva a uma fadiga muscular, prejudicando o desempenho físico das ratas, o que não foi verificado em nosso estudo. Em exercícios de intensidade intensa, ocorre a ativação de grande número de fibras musculares glicolíticas aumentando a concentração de lactato no sangue que caracteriza um exercício anaeróbio (36, 34, 28, 24).
No presente estudo, o teste oral de tolerância à glicose não mostrou valores glicêmicos superiores a 140 mg/dL em nenhum dos grupos experimentais (dados não mostrados), mostrando a ausência de intolerância à glicose. Isto foi confirmado pelo não surgimento de
Diabetes Mellitus gestacional. Além disso, os animais não mostraram alterações nas
concentrações de glicogênio hepático e HDL-colesterol nos grupos estudados. No final do período de prenhez e na lactação, as ratas PIP, independentemente da presença da natação, apresentaram pesos corpóreos, glicemias, níveis de triglicérides, HDL-colesterol, hormônios sexuais e concentrações de glicogênio hepático similares às ratas que nasceram com peso adequado.
Em conclusão, o crescimento das ratas PIP foi beneficiado por um catch up retardado/atrasado. Além disso, foi demonstrado que o exercício físico não prejudicou as ratas que nasceram com RCIU e causou benefícios com relação à redução nos níveis de triglicérides durante a prenhez. O fato desses animais não apresentarem alterações metabólicas e hormonais no início da fase adulta não descarta a possibilidade do surgimento de doenças na fase adulta tardia visto que eles se desenvolveram em um ambiente intrauterino desfavorável.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à equipe do Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia (LAPGO); à Talísia Moretto, assistente de suporte acadêmico, pelo auxílio técnico; à Aline de Oliveira Netto, aluna de pós-graduação (nível mestrado) pelo auxílio no cuidado com os animais e discussões científicas; ao Grupo de Apoio à Pesquisa (GAP), especialmente ao Prof. Dr. José Eduardo Corrente pela contribuição no delineamento do estudo e análise estatística.
FINANCIAMENTOS
Os autores agradecem à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida à aluna Silvana Barroso Corvino.
REFERÊNCIAS
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