4 Det skandinaviske materialet
4.1 Historisk bakgrunn
PEPTÍDEO ESTRUTURAS PRIMÁRIAS DAS RANASEPTINAS MASSA MOLECULAR MONOISOTOPICA em Daltons DO PEPTÍDEO MADURO MASSA MOLECULAR MONOISOTOPICA em Daltons DO FRAGMENTO N-TERMINAL MASSA MOLECULAR MONOISOTOPICA em Daltons DO FRAGMENTO C-TERMINAL Rsp-1 AWLDKLKSLGKVVGKVALGVAQNYLNPQQ 3136,78 1512,90 1641,88 Rsp-2 AWLDKLKSLGKVVGKVAIGVAQHYLNPQQ 3159,79 1512,90 1664,90 Rsp-3 AWLDKLKSIGKVVGKVAIGVAKNLLNPQ 2958,77 1512,90 1463,88 Rsp-4 AWLDKLKSLGKVVGKVGLGVVQNYLNPRQ 3178,83 1512,90 1683,94 Rsp-5 AWLDKLKNLGKVVGKVALGVVQNYLNPRQ 3219,86 1539,91 1697,96 Rsp-6 ALLDKLKSLGKVVGKVALGVVQNYLNPRQ 3119,85 1439,91 1697,96 Rsp-7 ALLDKLKSLGKVVGKVALGVAQHYLNPQQ 3086,80 1439,91 1664,90 Rsp-8 ALLDKLKSLGKVVGKVAIGVAQHYLNPQQ 3086,80 1439,91 1664,90 Rsp-9 ALLDKLKSLGKVVGKVAIGVAQHYLNPQ 2958,74 1439,91 1536,84
Essa fração foi submetida à recromatografia por RP-HPLC empregando-se uma coluna C18 da Phenomenex o que permitu a obtenção de
um componente principal que eluiu com tempo de retenção de 36,5 min (Figura 11), o qual mostrou-se homogêneo quando analisado por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF (Figuras 12). A diferença de cerca de 1 Da nas massas moleculares observadas nos espectros de massas da fração 28 e da fração resultante da sua recromatografia pode ser explicada por uma calibração incorreta do espectrômetro de massas antes das análises. Novas análises no espectrômetro de massas serão realizadas com ambas as
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32 frações logo após uma calibração mais criteriosa do equipamento de modo a eliminar dúvidas quanto à massa molecular do peptídeo purificado.
Figura 11. Perfil cromatográfico resultante da recromatografia da fração 28 em coluna C18 da Phenomenex. A fração eluída no tempo de
retenção de 36,5 min foi manualmente coletada, seca a vácuo e analisada por MALDI-TOF MS. 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 mV 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 %
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33 Figura 12. Espectro de massas da fração com tempo de retenção de 36,5 min obtida com a recromatografia da fração 28 em coluna C18 (matriz: HCCA; MALDI-TOF MS).
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34 Uma vez que a estratégia cromatográfica empregada foi eficiente na purificação do peptídeo ativo, agora denominado HR 36, tendo em vista seu tempo de retenção (sua eluição ocorreu após 36,5 min) na recromatografia, tal peptídeo puro foi acumulado em quantidade suficiente para a realização de um ensaio para a determinação do seu MIC sobre o fungo patogênico
Candida albicans. Após incubação de diferentes concentrações do peptídeo
HR 36 com uma suspensão de C. albicans não foi possível a determinação do seu MIC frente a esse patógeno, uma vez que foi observada uma inibição parcial (de cerca de 50%) nas duas maiores concentrações empregadas (128 e 64 µM), confirmando a susceptibilidade de C. albicans a esse peptídeo, mas também evidenciando ser esse efeito considerado fraco em comparação com outros PAMs com atividade anti-Candida já isolados da secreção cutânea de anuros, cujos MICs encontram-se entre 4-12 µM (Li et al., 2013).
Figura 13. Efeito da incubação de doses crescentes do peptídeo HR 36 sobre a proliferação do fungo patogênico Candida albicans.
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 128 64 32 16 8 4 2 P o rc e n ta g e m d e C re sc im e n to ( % ) Concentração em MMMM
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35 Muitos estudos são direcionados para a identificação, purificação e caracterização estrutural de peptídeos antimicrobianos devido ao fato que estes compostos presentes nos anuros são produzidos como parte de uma mistura de componentes bioativos que incluem também aminas biogênicas, bufadienolídeos e alcalóides, em resposta a estímulos que ativam as glândulas serosas localizadas de forma assimétrica na superfície dorsal dos anuros (Pukala et al., 2006).
Ate o momento, os PAMs mais estudados são as magaininas isoladas da rã Xenopus laevis, bem como seus análogos, que exibem amplo espectro de ação incluindo bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos, vírus e protozoários, não exibindo atividade citolítica significativa sobre células de mamíferos, como demonstrado em diversos trabalhos (Soravia et al., 1988; Bessale, et al., 1992; De Lucca & Walsh, 1999; Avrahami & Shai,2002; Sitaram & Nagaraj, 2002; Pukala et al., 2006). A magainina 2 é um peptídeo com propriedades não-hemolíticas que inibe o crescimento de C. albicans, apresentando um MIC igual a 80 µg/mL, além de agir sobre outros fungos como C. neoformans e S. cerevisae (Zasloff, 1987).
Da secreção de Xenopus laevis também foi isolado o peptídeo PGLa, um peptídeo de 24 resíduos de aminoácidos com atividade inibitória sobre várias cepas patogênicas de Candida e C. neoformans (Helmerhost et al.,1999; Lohner & Prossnigg, 2009) sendo que a espécie C. glabrata foi menos sensível a esse peptídeo (Helmerhost et al.,1999). Em 2000, Van’t Hoff et al. demostraram que a associação de AmB com PGLa apresentou um efeito sinérgico contra diferentes cepas de Aspergillus, Candida e Cryptococcus. Ressalta-se que A. fumigatus, um fungo resistente à anfotericina B, mostrou-se bastante sensível à PGLa (Rollins-Smith et al. 2002).
As esculentinas 1 e 2, peptídeos com 46 resíduos de aminoácidos, os maiores peptídeos de anfíbios anuros conhecidos até o momento, foram isolados da rã Rana esculenta e formam um grupo de peptídeos que apresentam grande atividade sobre bactérias e uma potência moderada contra
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36 o fungo C. albicans (Simmaco et al.,1994; Goraya et al., 2000; Conlon et al., 2004).
Outra espécie de anfíbio anuro chamada de Lithobates catesbeianus, comumente conhecida como rã-touro, apresenta na sua secreção um peptídeo denominado ranatuerina 1 que exibe uma forte atividade inibitória sobre E. coli,
S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans (Goraya et al.,1999; Kim et al., 2000;
Halverson et al., 2000). Conlon et al. (2004) reportaram que um aumento na cationicidade deste peptídeo pela substituição de um resíduo de asparagina na posição 8 por uma lisina resulta em um análogo até seis vezes mais ativo sobre
E. coli e duas vezes mais sobre S. aureus e C. albicans, mantendo uma
atividade hemolítica baixíssima. Ao mesmo tempo, um aumento na α-helicidade pela substituição de um outro resíduo de asparagina na posição 22 por uma alanina, aumentou em duas vezes o poder antimicrobiano do peptídeo, mas triplicou a atividade hemolítica sobre eritrócitos humanos (Conlon et al., 2004).
Um outro grupo de peptídeos denominado temporinas foi isolado inicalmente da secreção da rã Rana temporaria. As temporinas são constituídas por pequenos peptídeos lineares (10 a 14 resíduos de aminoácidos), com capacidade de formar α-hélice, sendo anfipáticos, hidrofóbicos, catiônicos e contendo C terminal amidado (Simmaco et al., 1998). Geralmente, as temporinas apresentam um único resíduo de aminoácido básico (usualmente a lisina) podendo ser este o motivo pelo qual elas são ativas apenas contra bactérias Gram-positivas (como, por exemplo, S. aureus) com MICs que variam entre 1 e 100 µM (Conlon et al., 2006). Enquanto que a temporina L apresenta dois resíduos básicos e exibe atividade contra bactérias Gram-negativas como E. coli e P. aeruginosa, como também contra C. albicans (Rinaldi et al., 2002).
Outro peptídeo deste grupo é a temporina 1Dra isolada de Rana
draytonii. Este peptídeo possui dois resíduos básicos e apresenta atividade
contra E. coli, S. aureus e C. albicans com MICs iguais a 16, 8 e 32 µM respectivamente. No entanto também apresenta atividade hemolítica em
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37 concentrações acima de 65 µM, reduzindo assim o seu potencial terapêutico (Conlon et al., 2006).
Nos anuros da família Hilidae, gênero Phyllomedusa, foram isoladas as dermaseptinas que apresentam propriedades líticas in vitro sobre bactérias, protozoários, leveduras e fungos filamentosos (Mor et al., 1994).
Outro gênero de anuros que possui peptídeos antimicrobianos importantes é o gênero Leptodactylus. Um exemplo de PAM que merece ser mencionado é a pentadactilina isolada de Leptodactylus pentadactylus que possui atividade sobre C. albicans (em concentrações bastante elevadas, >200
µM), forte atividade contra bacterias Gram-positivas e Gram-negativas e fraca atividade hemolítica (King et al., 2005).
Existem também exemplos de PAMs isolados de outros órgãos, como estômago, como a bufoterina I (peptídeo linear com 39 resíduos de aminoácidos) (Park et al., 1998; Cho et al., 2009). Esse peptídeo possui um amplo espectro de atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (B. subtilis e S. aureus), banctérias Gram-negativas (E. coli), e fungos (C. albicans, C. neoformans e S.cerevisae) (Choet al., 2009).
É importante ressaltar que existem poucos trabalhos na literatura descrevendo as atividades biológicas dos peptídeos presentes nas secreções de anuros do gênero Hypsiboas. Dentre eles, Prates et al. (2004) isolaram um PAM denominado hylaseptina P1 (HSP1) da secreção de Hyla punctata (atualmente Hypsiboas punctatus). Este peptídeo apresentou atividade contra
C. albicans, S. aureus, E. coli e P. aeruginosa.
Castro et al. (2005) isolaram dois peptídeos da secreção de Hyla
biobeba (atualmente a espécie é conhecida como Hypsiboas lundii)
denominados hylina b1 (Hy-b1) e hylina b2 (Hy-b2). Esses peptídeos possuem 19 resíduos de aminoácidos cada, são catiônicos, ricos em resíduos hidrofóbicos. Tais peptídeos mostraram-se estruturalmente relacionados com as bombininas H isoladas de anuros do gênero Bombina.
Com taxas de similaridade estrutural entre 48% e 65% entre as bombininas H e as hylinas b1 e b2, esses dois novos peptídeos são os
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38 primeiros exemplos de peptídeos relacionados com as bombina H isolados de anuros não relacionados filogeneticamente com o gênero Bombina (Castro et
al., 2005).
Em outro trabalho com a espécie Hypsiboas albopunctatus foi isolada a hylina a1, um peptídeo linear de 18 residuos de aminoácidos ativo contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus;
E. faecalis e B subtilis), assim como contra os fungos C. neoformans, C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis. Infelizmente tal peptídeo exibiu
atvidade hemolítica contra eritrócitos humanos dificultando desta forma o seu emprego como uma alternativa clínica aos antibióticos atuais.
O último trabalho disponível na literatura envolvendo anuros do gênero
Hypsiboas foi realizado por Magalhães et al. (2008). Nesse trabalho foi
identificada uma nova família de peptídeos antimicrobianos, denominados raniseptinas, a partir da espécie alvo do presente estudo, Hypsiboas raniceps. O peptideo raniseptina 1 (Rsp-1) foi isolado e apresentou atividade antimicrobiana sobre diferentes bactérias, sem no entanto apresentar efeitos citolíticos sobre eritrócitos humanos. As propriedades antimicrobianas da Rsp-1 foram demonstradas contra três bactérias patogênicas: E. coli, P. aeruginosa e
S. aureus. A raniseptina 1 foi selecionada para a realização destes ensaios
devido à sua abundância quando comparada com as outras raniseptinas presentes nessa secreção, sendo que a Rsp-1 equivale a 8% do total dos peptídeos contidos na secreção. Os valores dos MICs para as bactérias Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa foram 5 e 10 µM, respectivamente, para o peptídeo maduro íntegro (29 resíduos de aminoácidos).
Fica evidente a importância de se ampliar os estudos com anuros do gênero Hypsiboas, pois eles podem representar uma fonte abundante de peptídeos ativos contra organismos patogênicos, incluindo os fungos.
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39 CONCLUSÃO
No presente estudo foi comprovada a presença de peptídeos com atividade antiproliferativa sobre o fungo patogênico Candida albicans na secreção cutânea da rã Hypsiboas raniceps. De acordo com a estratégia experimental empregada foi possível o isolamento e a caracterização parcial de um peptídeo com atividade inibitória sobre a proliferação de C. albicans. Tal peptídeo, denominado HR 36, apresentou massa molecular igual a 3 kDa e foi capaz de inibir em 50% o crescimento da levedura C. albicans nas concentrações de 128 e 64 µM.
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40 PERSPECTIVAS
Como perspectivas imediatas do presente trabalho, podem ser relacionadas as seguintes etapas:
Determinação da estrutura primária do peptídeo HR 36;
Produção, por síntese química, do peptídeo HR 36 empregando-se química Fmoc;
Tendo disponibilidade de material, proceder à determinação das atividades inibitórias do peptídeo HR 36 sobre a proliferação de diferentes organismos patogênicos como fungos (Candida
albicans, C. krusei e C. parapsilosis e Crytococcus neoformans),
bactérias (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae,
P. mirabilis, E. faecalis) e protozoários (T. cruzi, L. brasiliensis, P. falciparum);
Avaliação dos efeitos citotóxicos do peptídeo HR 36 sobre células tumorais;
Avaliação dos efeitos citolíticos do peptídeo HR 36 sobre células sanguíneas humanas.
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Dissertação de Mestrado Diego Alejandro Falico
Identificação, purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos presentes na secreção cutânea do anuro Hypsiboas raniceps