4. Case study
4.2 Historical background
Frutos e tratamentos
Frutos de tomateiro foram cultivados segundo condições padrões de casa de vegetação. Aproximadamente 400 frutos, provenientes de mais de 50 plantas, foram colhidos no estágio mature green (MG) e foram divididos em quatro grupos de 100 frutos de acordo com os tratamentos a seguir: tratamento com injeção de solução base (sorbitol 3% em tampão MES 10 mM, pH 5,6) acrescida de 100µM de AIA (grupo AIA); tratamento com etileno gasoso 100 ppm durante 12h seguido da injeção da solução base (grupo etileno); tratamento com injeção de AIA 100µM veiculada pela solução base após a exposição ao etileno gasoso durante 12 horas (grupo etileno+AIA); tratamento com injeção da solução base (grupo controle). As injeções foram aplicadas de modo similar ao descrito por Orzaez et al. (2006) (Figura S1 – Material suplementar).
Testes preliminares foram realizados para a seleção da concentração para o tratamento com AIA e etileno, utilizando a cor dos frutos como principal parâmetro para avaliação do efeito dos hormônios. A solução base foi preparada conforme descrito previamente (SU et al., 2015). Frutos foram injetados com solução aquosa do corante azul de bromofenol com o intuito de verificar a eficiência da injeção nos diferentes tecidos (Figura S2 – Material suplementar). Após os tratamentos, os frutos foram mantidos em câmara B.O.D. a 22°C +/- 2°C com foto período de 16 horas de luz (tipo incandescente e intensidade de 110μmol s-1 m-2) para 8 horas de escuro e
80% de umidade relativa. Para ensaios posteriores, 10 frutos representativos de cada grupo experimental foram retirados da B.O.D em 6 diferentes estágios de amadurecimento ao longo de 14 dias e armazenados inteiros em ultrafreezer a -80 °C após o congelamento em N2 líquido. Para posterior análise de compostos
voláteis, cinco frutos representativas de cada condição experimental foram fatiados e congelados a -20°C em solução de NaCl 30%. O experimento foi conduzido durante 14 dias, tempo necessário para o completo amadurecimento dos frutos, usando como referência as amostras do grupo controle (Figura S3 - Material suplementar). Além das amostras representativas do 14º dia após os tratamentos, foram analizadas amostras referentes ao 1º, 2º, 4º e 10º dias após tratamentos, sendo o 4º dia correspondente ao estágio “breaker” nos frutos do grupo controle. Para melhor interpretação de algumas análises, houve a necessidade de avaliar “pontos intermediários”.
Cor dos frutos
Para cada grupo experimental, 5 frutos foram coletados antes dos tratamentos e também em 1, 2, 4, 10 e 14 dias após os tratamentos com o intuito de medir a cor da superfície dos mesmos. As medidas foram feitas em quadruplicata em cada fruto. A cor foi mensurada através de um colorímetro (HunterLab ColorQuest XE) e expressa em relação ao valor de matiz (Hue) calculado pela fórmula Hue = tan-1 (b/a), onde “b” (quantidade de amarelo e azul) e “a” (quantidade entre vermelho
e verde) são valores fornecidos pelo equipamento, levando em conta o plano de cores descrito pelo método Hunter (FABI et al., 2007).
Estimativas da produção de etileno
Para cada condição experimental, 3 frascos contendo 25g de frutos cada um (8 frutos), foram vedados e após 1 hora foram retiradas 10 alíquotas dos
headspaces desses frascos. Estas amostras foram injetadas em um cromatógrafo a
gás da Hewlett-Packard modelo GC-6890 equipado com detector por ionização de chama (FID, do inglês flame ionization detector). A coluna utilizada foi a HP-Plot Q (30 m, D.I. 0,53 mm). As condições de injeção foram: pressão de 20 psi por 2 minutos, fluxo de ventilação de 20 mL/min após 30 segundos de injeção e temperatura do injetor em 200°C. As demais condições cromatográficas empregadas foram: corrida isotérmica a 30ºC empregando hélio como gás carregador em fluxo constante de 1 mL/min; temperatura do detector em 250°C, fluxo de ar e hidrogênio no detector em 450 mL/min e 50 mL/min, respectivamente. A estimativa da
55 quantidade de etileno produzida pelos frutos foi feita em relação à injeção de um padrão de 0,1 µL/L de etileno em ar sintético da Air Liquid.
Determinação de AIA livre
A determinação de ácido indol-3-acético (AIA) foi realizada segundo metodologia proposta por Ludwig-Müller et al. (2008) com modificações.
Em um microtubo de 2 mL, foram adicionados aproximadamente 500 mg de amostra triturada (frutos inteiros, incluindo as sementes) em N2 líquido, 1 mL de
solução extratora contendo isopropanol e ácido acético (95:5) e 2 µg de padrão marcado de AIA [13C
6] (Cambridge Isotopes, Andover, MA, EUA). Em seguida, a
mistura foi agitada em vórtex por aproximadamente 1 minuto e o material incubado sob agitação a 4°C por 2 horas. O homogenato resultante foi então centrifugado na mesma temperatura por 10 minutos a 13000 X g e o sobrenadante transferido para um novo microtubo. O material foi concentrado em concentrador rotacional a vácuo (SpeedVac) até restar cerca de 50 µL de amostra. Em seguida, foi realizado o ajuste do pH entre 2,5 e 3,5 utilizando HCl 1N. Após isso, foram adicionados 500 µL de acetato de etila ao material, seguido de agitação em vórtex e centrifugação a 13000 X g por 5 min a 4°C para separação de fases. A fase orgânica (superior) foi coletada e transferida para um novo microtubo, enquanto a fase aquosa (inferior) foi submetida a mais duas etapas de extração com acetato de etila. Após combinação das extrações das fases orgânicas, foi efetuada a secagem completa em SpeedVac. As amostras foram ressuspendidas em 100 µL de metanol e transferidas para um
insert de vial de 300 µL. Após secagem completa destas em SpeedVac, foi
adicionado 25 µL de piridina e 25 µL de N-terc-butil(dimetilsilil)-N-(metil)- trifluoroacetamida (MTBSTFA - Sigma-Aldrich - 375934) incubando em seguida por 1 hora a 92 °C.
Para a detecção e quantificação, foi utilizado o método de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas, em modo de monitoramento seletivo de íons (GC-MS-SIM, do inglês Chromatography Mass Spectrometry in the Selected
Ion Monitoring Mode). Para isso, foi utilizado um cromatógrafo gasoso (HP-6890,
Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EUA) equipado com espectrômetro de massas (HP- 5973), injetor automático (ALS 7693, Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e coluna DB- 5ms (30 m x 0,25 mm x 0,50 µm). Foi injetado 1 µL de cada amostra para análise do
AIA em modo splitless. O fluxo de hélio foi mantido a 0,83 mL/minuto e as condições da corrida foram: 100°C por 2 minutos; 100°C a 140°C a 10°C/minuto; 140°C a 160°C a 25°C/minuto, mantendo por 1 minuto; 160°C a 250°C a 35°C/minuto, mantendo por 1 minuto; 250°C a 270°C 20 °C/minuto, mantendo por 1 minuto; 270°C a 300°C a 30°C/minuto, mantendo por 2 minutos. Foram monitorados os íons com relação massa carga (m/z) em 130 e 232 (correspondentes ao AIA endógeno) e 136 e 238 (correspondentes ao padrão interno [13C6]-AIA). As concentrações foram
obtidas pela relação entre as áreas dos picos dos cromatogramas extraídos em m/z 232 e 238.
Determinação das formas conjugadas de AIA
A determinação das frações conjugadas foi feita por extração em fase sólida, segundo método adaptado de Chen et al. (1988).
Em tubo de centrífuga (COREX®) de 15 mL, foram adicionados 2 mL de solução extratora (65% de isopropanol em tampão imidazol 0,2 M e pH 7,0), 500 mg de amostra (frutos inteiros, incluindo as sementes) triturada em N2 líquido e 2 µg de
padrão marcado de AIA [13C
6] (Cambridge Isotopes, Andover, MA, EUA). A mistura
foi homogeneizada por 3 minutos, centrifugada a 13000 X g por 10 minutos e o sobrenadante foi coletado em tubo de plástico côncavo de 15 mL. Em seguida, foi evaporado o isopropanol, que corresponde a 65% do volume. Do volume restante, 500 µL foram transferidos para tubo de vidro resistente a altas temperaturas e o remanescente permaneceu no tubo de plástico. Ao tubo de vidro, foram adicionados 500 µL de NaOH 7N, com posterior incubação por 3 horas a 100°C, sendo esta etapa correspondente à extração da fração amida. Ao tubo de plástico, por sua vez, foram adicionados 500 µL de NaOH 1N, seguido de incubação por 1 hora a temperatura ambiente, correspondendo à extração da fração éster.
As resinas utilizadas para extração foram C18 (Supelclean – LC – C18) e NH2
(Supelclean – LC – NH2). Cartuchos de 5 mL foram preenchidos com 500 mg de
ambas as resinas. Antes da eluição das amostras, foi realizado o pré- condicionamento das colunas resultantes. Para a C18, utilizaram-se nesta ordem: 5
mL de hexano, 5 mL de metanol, 5 mL de água Milli-Q, 5 mL de ácido acético 1%. Para a NH2: 2 mL de hexano, 2 mL de acetonitrila, 2 mL de água Milli-Q (2 vezes), 2
57 Antes de iniciar as eluições, o pH de todas as amostras, tanto das frações éster quanto das frações amida, foi ajustado para 2,5. As amostras passaram primeiramente pela coluna C18, com posterior lavagem desta com água Milli-Q. Após
isso, foram eluídos 2 mL de acetonitrila, coletando o extrato em tubos de plástico de 15 mL. Este extrato foi diluído utilizando 18 mL de tampão imidazol 0,02 M (pH 7,0) e, em seguida, foi vertido na coluna NH2. Após isso, foram realizadas lavagens com
2 mL de hexano, 2 mL de acetato de etila, 2 mL de acetonitrila e 2 mL de metanol, nesta ordem. Finalmente, foram eluídos 3 mL de ácido acético 2% em metanol e coletados em tubos de plástico. Os extratos foram evaporados completamente em
SpeedVac e ressuspendidos em 100 µL de metanol.
Para a derivatização, as amostras foram transferidas para vials. Nestes, foram adicionados 100 µL de trimetilsilil diazometano (362832 – Sigma-Aldrich), seguido de incubação a temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, as amostras foram secas em fluxo de nitrogênio, ressuspendidas com acetato de etila e transferidas para inserts específicos para injeção no cromatógrafo.
A detecção e quantificação foram realizadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas, em modo de monitoramento seletivo de íons (GC-MS-SIM). Utilizou-se cromatógrafo gasoso (HP-6890, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, EUA) equipado com espectrômetro de massas (HP-5973), injetor automático (ALS 7693, Agilent, Santa Clara, CA, EUA) e coluna HP 1701 (30 m x 0,25 mm x 0,50 µm). Foi injetado 1 µL de cada amostra para análise do AIA em modo splitless e o fluxo de hélio foi mantido a 1 mL/minuto. As condições da corrida foram: 150°C por 3 minutos; 150°C a 200°C a 4°C/minuto; 200°C a 300°C a 10°C/minuto. Foram monitorados os íons com relação massa carga (m/z) em 130 e 189 (correspondentes à AIA endógeno) e 136 e 195 (correspondentes ao padrão interno [13C6]-AIA). As concentrações endógenas de AIA foram obtidas pela relação
entre as áreas dos picos no cromatogramas extraídos em m/z 130 e 136.
Análise de compostos voláteis
As análises dos compostos voláteis foram realizadas em triplicata, utilizando o método de micro-extração em fase sólida (SPME, do ingês Solid Phase
Microextraction), de acordo com o método descrito por Pesis et al. (2009). A análise
de espessura da Supelco® (CAR/DVB/PDMS).
Aproximadamente 3g de frutos, provenientes de uma mistura de cinco frutos inteiros (incluindo as sementes), foram finamente fatiados com lâmina de aço inox e, em seguida, acrescidos de 7 mL de solução de NaCl a 30% (p/v) em vials de 20mL, com tampa de septo de silicone, que foram congelados a -20ºC para análise posterior. O material foi descongelado a 40ºC em banho-maria com agitação intensa a 600 rpm através de barra magnética. Os voláteis foram acumulados por 10 minutos no headspace do vial, onde a fibra de SPME foi introduzida por mais 50 minutos. Uma vez capturados, os compostos voláteis foram dessorvidos da fibra pela exposição ao calor do injetor do cromatógrafo (200ºC) por 3 minutos. Foi utilizado o cromatógrafo Hewlett-Packard modelo 6890 acoplado a um detector seletivo de massas da mesma empresa, modelo 5973. A coluna cromatográfica empregada foi a Supelcowax 10 (30 m, 0,25 mm de diam. interno, 0,25 μm de espessura do filme). O programa de temperatura utilizado foi: rampa de temperatura de 2ºC/min de 40°C à 150ºC. A temperatura da interface entre o cromatógrafo e o detector seletivo de massas foi de 230ºC e a ionização foi feita por impacto de elétrons (70 eV) com a fonte de íons mantida a 150ºC.
Testes preliminares foram feitos com diferentes quantidades de amostra (2 ou 3g), concentrações da solução de NaCl (10, 20 ou 30%), tempos de equilíbrio entre a amostra e os voláteis no headspace do vial (10 ou 15 minutos), temperaturas de aquecimento (30 ou 40°C), e tempos de exposição da fibra no headspace (30 ou 50 minutos). O critério utilizado para avaliação desses parâmetros foi baseada na qualidade dos cromatogramas gerados, considerando o número, tamanho e área dos picos. Dessa forma, foi possível determinar as melhores condições para o ensaio. As análises foram realizadas em triplicata para cada uma das amostras. Os espectros de massas obtidos foram comparados com os da biblioteca NIST versão 1.6 e considerados apenas aqueles com índice de similaridade acima de 70%.
Análises de carotenóides
Para análises de carotenóides, frutos inteiros (incluindo as sementes) foram moídos em nitrogênio líquido até formarem um pó e em seguida submetidas a extração pelo método descrito por Sérino et al. (2009).
59
Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real
Partindo dos frutos (inteiros, incluindo as sementes) triturados em N2 líquido,
o RNA foi extraído através do reagente para extração de RNA em plantas PureLink™ (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida as amostras foram tratadas com DNase seguindo o kit Ambion® DNA-free™ DNase Treatment & Removal Reagents (Invitrogen). A quantidade de RNA foi calculada por espectrofotometria (SAMBROOK et al., 1989) considerando que uma amostra contendo 40 μg/mL de RNA apresenta valor de absorbância igual a 1,0 a 260 nm. Somente amostras de RNA total com razões A260/A280 entre 1,8 e 2,0 foram utilizadas na síntese do DNA complementar (cDNA), para a qual foi utilizada a reação da transcriptase reversa conforme instruções contidas no kit ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega).
As reações em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foram feitas a partir dos cDNAs, utilizando primers específicos para os genes: SlLOX, SlHPL,
SlADH, SlCCD1A e SlCCD1B. O kit empregado foi o Power Sybr® Green PCR
Master Mix da Applied Biosystems e o equipamento da mesma empresa, seguindo todas as recomendações quanto aos controles da análise descritos nos manuais. Foram utilizados os genes constitutivos TIP41 e uma “Expressed Protein” como controles endógenos e a expressão relativa foi obtida de acordo com Pfaffl (2001), utilizando o cálculo 2(‐∆∆Ct). Foram adotadas como referência as amostras de frutos
no dia em que foram coletados (antes dos tratamentos). As sequência dos primers estão listadas em Material suplementar: Tabela S1.
Análises estatísticas
Os dados referentes às áreas dos picos dos compostos voláteis, obtidos através dos cromatogramas, foram normalizados pela média. A partir das matrizes de correlações dos dados normalizados foram feitas análises de componentes principais (ACP, biplot) através do software XLSTAT. Para as análises de variância (ANOVA), teste de Fisher’s LSD (do inglês, Least Significant Difference test), análise FDR (do inglês, False Discovery Rate), agrupamento hierárquico e heatmap, os dados foram transformados em escala de Log2 após a normalização, e o software
dados foram processados separadamente, por dia após tratamentos. Os métodos utilizados para a análise de agrupamento hierárquico foram: distância euclidiana e algoritmo aglomerativo de Ward (WARD, 1963).
Resultados
Parâmetros do amadurecimento e níveis hormonais
Com a finalidade de caracterizar os estágios de amadurecimento dos frutos controle (C) e dos frutos tratados com os hormônios etileno (E), AIA (A) e etileno+AIA (E+A), parâmetros típicos do amadurecimento foram avaliados 6h e 1, 2, 4, 10 e 14 dia(s) após os tratamentos (D1, D2, D4, D10 e D14, respectivamente).
Os resultados indicam que a mudança da cor verde para vermelha foi acelerada pelo tratamento “E” (Figura 1). Por outro lado, os tratamentos “A” e “E+A”, proporcionaram efeito contrário e, dentro do período analisado, a cor vermelha não foi observada. No último dia do experimento (D14), os frutos “C” já haviam atingido o completo amadurecimento (Figura 1).
61
Figura 1 Efeitos de tratamentos hormonais sobre a coloração de tomates da cultivar Micro-Tom. Aparência dos frutos de tomateiro (esquerda) e cor da casca dos frutos em função do tempo após tratamentos com AIA, etileno e etileno+AIA, (grupo controle = não tratado). D1, D2, D4, D10 e D14 referem-se aos dias após tratamentos. D0= antes dos tratamentos. Os pontos e as barras correspondem a média + desvio padrão (n= 5).
Os níveis de etileno foram monitorados não apenas como um parâmetro do amadurecimento, que reflete os estágios fisiológicos e está subjacente às diferenças observadas na maturação, mas também com a finalidade de avaliar a eficácia do tratamento “E”, pois o mesmo pode ser considerado um controle positivo dos experimentos. Os frutos deste grupo apresentaram a produção de etileno aproximadamente quatro vezes maior quando comparados aos frutos “C” em D1 e revelaram concentrações acentuadamente maiores entre D2 e D4. Em resposta ao tratamento “E+A”, os níveis pouco variaram ao longo dos dias avaliados. O tratamento ”A”, por sua vez, causou um adiantamento do pico da produção de etileno em relação ao grupo “C” (Figura 2A).
63 Figura 2 Perfis de variação de etileno, AIA livre e conjugados, em frutos de tomateiro da cultivar Micro-Tom em função dos tratamentos com AIA, etileno e etileno+AIA, (grupo controle = não tratado). A) Perfis de produção de etileno, B) níveis de AIA livre, C) e níveis dos conjugados AIA-ester e D) AIA-amida, após tratamentos hormonais. D1, D2, D4, D8, D10 e D14 referem-se aos dias após tratamentos. 6h= seis horas após os tratamentos. D0= antes dos tratamentos. Barras verticais indicam desvio padrão da média (n=3).
Conforme o esperado, os níveis de AIA livre e conjugados foram aumentados pelo tratamento “A” e nos frutos do tratamento “E+A” também foram detectados altos níveis desse hormônio nas três formas avaliadas (Figura 2B-D). Seis horas após os tratamentos, esses dois grupos de frutos apresentaram acúmulo da forma livre de aproximadamente seis e quatro vezes maior que os frutos “C”, respectivamente e, no grupo “A”, acompanhado também de altos níveis de conjugação das duas formas avaliadas. Após 6 horas do tratamento “E”, os frutos apresentaram baixo nível de AIA livre (dez vezes menor em relação aos frutos do grupo “C”) e níveis maiores de AIA-amida quando comparados ao grupo “C”.
Variação no perfil de compostos voláteis
Com o intuito de investigar possíveis impactos sobre componentes do aroma em resposta aos diferentes tratamentos hormonais, foram realizadas análises de compostos voláteis, pela técnica de SPME. Ao todo foram detectados 22 desses metabólitos voláteis (Tabela 1), sendo cada um deles contribuintes do aroma através de notas odoríferas e limiares de odor variados. Seis dos 22 compostos possuem como precursores os isoprenóides, dois derivam diretamente de carboidratos, oito são biossintetizados na via da lipoxigenase, tendo os ácidos graxos como precursores, e seis são obtidos através da degradação de aminoácidos.
65 Tabeta 1 – Descrição dos compostos voláteis emitidos por frutos de tomateiro (Micro-Tom) não tratados (C) e tratados com Etileno (E), AIA (A) e Etileno+AIA (E+A) e diferenças estatísticas dos
grupos “E”, “A” e “E+A” em relação a “C”, quatro e quatorze dias (D4 e D14) após os tratamentos. D4 E D4 A D4 E+A D14 E D14 A D14 E+A cis-3-hexenal
004440-65-7 1157 1146 Folha verde 0,25 Ácidos gráxos
nonanal
000124-19-6 1388 1385 Cítrico, floral 1 Ácidos gráxos
trans-2-octenal
002548-87-0 1425 1442 Folha verde 3 Ácidos gráxos
hexanal
000066-25-1 1085 1084 Folha verde 4,5 Ácidos gráxos
trans-2-heptenal
018829-55-5 1321 1336 Folha verde 13 Ácidos gráxos
trans-2-hexenal
006728-26-3 1222 1220
Verde,
frutado 17 Ácidos gráxos
trans,trans-2,4-
hexadienal 000142-83-6
1407 1337 Cítrico, verde 10 a 60 Ácidos gráxos ND ND ND
cis-3-hexenol
000928-96-1 1381 1386 Folha verde 70 Ácidos gráxos
2-isobutiltiazol 018640-74-9 1393 1396 Folha verde, tomate 2 a 3,5 Aminoácidos metil heptanoato 000106-73-0 1284 1288 Frutado 4 Aminoácidos ND ND ND metil salicilato 000119-36-8 1761 1745 Mentolado 40 Aminoácidos estireno 000100-42-5 1248 1241 Floral adocicado 730 Aminoácidos ND ND ND 2-etilhexanol 000104-76-7 1487 1487 Floral 270000 Aminoácidos ND ND ND BHT (2,6-di-terc-butil-4- metilfenol) 000128-37-0 1905 NC Cânfora NC Aminoácidos ND ND ND 2-pentilfurano 003777-69-3 1211 1240 Frutado 6 Carboidratos ND ND ND 2-etilfurano 003208-16-0 NC 1701 Adocicado NC Carboidratos β-ionona 014901-07-6 1924 1912 Frutado 0,007 Isoprenóides β-ciclocitral 000432-25-7 1601 1598 Herbáceo 5 Isoprenóides citral 005392-40-5 1726 1602 Cítrico 32 Isoprenóides ND ND ND geranil acetona 000689-67-8 1850 1840 Floral, frutado 60 Isoprenóides ND ND ND 2,2,6- trimetilciclohexanona 002408-37-9 1305 NC amadeirado 100 Isoprenóides α-copaeno 3856-25-5 1475 1488 Amadeirado NC Isoprenóides ND ND ND Limiar de odor (ppb) *5 Precursor *6 Diferenças em relação ao Grupo Contole*7 Composto volátil/ CAS *1 Estrutura IR de Kovats (calculado) *2 IR de Kovats (literatura) *3 Notas de aroma *4
*1 Número de registro único no banco de dados do Chemical Abstracts Service, uma divisão da
Chemical American Society. *2 Índices de retenção de Kovats dos respectivos compostos voláteis,
calculados em relação a n-alcanos (C8 a C20) considerando a coluna Sulpelcowax 10. *3 Referências: Acree e Arn (2014) e El-Sayed (2014) *4 Referências: Burdock (2010) e The Good Scents Company, 2013. *5 Referência: Leffingwell and Associates. *6 Referências: Buttery e Ling (1993) e Schwab, Davidovich-Rikanati e Lewinsohn, 2008. *7 Seta para baixo indica diminuição, seta para cima indica aumento (FDR<0,05), hífen indica sem diferença estatística, em relação ao grupo de amostras controle (frutos não tratados). NC=IR não calculado ou IR / limiar de odor não encontrado na literatura. ND=composto não detectado.
A fim de identificar os voláteis constituintes do aroma, cujos níveis aumentaram ou diminuíram após a aplicação dos hormônios e que podem ser responsáveis por possíveis mudanças no aroma após os tratamentos, foram aplicadas análises estatísticas (ANOVA, FDR e Fisher’s LSD). Os níveis de todos os compostos voláteis detectados em D4 possuíam diferenças estatisticamente significantes (FDR ≤ 0,05) ao menos entre três pares de grupos experimentais, com exceção do cis-3-hexenol (Tabela 1 e Tabela S2 – Material suplementar). Em contraste, apenas 6 dos 16 compostos no D14 apresentaram diferenças estatísticas relevantes (FDR ≤ 0,05), entre eles o citral, composto característico do aroma em frutos maduros, o qual apresentou níveis diminuídos em frutos dos grupos “A” e “E+A” (Tabela 1 e Tabela S3 - Material suplementar).
Os dados também foram analisados utilizando métodos estatísticos multivariados não supervisionados (Análise de Componentes Principais [ACP], Análise de Agrupamento Hierárquico [AAH] visualizada por Heatmaps) com a finalidade de avaliar, de forma global, os impactos causados pelos tratamentos hormonais em relação às composições dos metabólitos voláteis. A ACP referente ao D4 (Figura 3A) revelou que os tratamentos proporcionaram aos frutos diferentes composições e/ou abundâncias de voláteis, pois os grupos projetaram-se em regiões distintas no plano. O primeiro componente principal (CP1), que explica 48,12% do total da variabilidade, claramente separou as amostras “C” na região positiva e os demais grupos de amostras na região negativa. Nesta mesma figura é possível identificar os principais metabólitos envolvidos nessa diferenciação: 3- hexenal, 2,4-hexadienal, 2-etilhexanol e estireno, próximos à extremidade positiva do CP1, enquanto os compostos isobutiltiazol e metil heptanoato na extremidade negativa. Isso sugere que as principais diferenças, entre os frutos do grupo “C” e