4.1 - Amostras Bacterianas
Foram selecionadas para o estudo 11 amostras de E. cloacae isoladas de hemoculturas de pacientes internados no Hospital São Paulo, entre janeiro de 2003 e março de 2004, e previamente categorizadas como resistentes a cefepima pela metodologia de Etest (Da Silva, 2005). Os dados clínicos dessas amostras encontram-se em anexo (Anexo I). Todas as amostras estavam bancadas em caldo tríptico de soja (TSB - Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com glicerol 15% a -20ºC no banco de microrganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC. As amostras tiveram a confirmação do gênero e da espécie pelo sistema Vitek (Biomeriux Vitek Inc., Hazelwood, MO).
4.2 - Avaliação do Perfil de Susceptibilidade
O perfil de susceptibilidade das 11 amostras de E. cloacae foi avaliado pela técnica de difusão em disco para as diferentes classes de antimicrobianos e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) para os β-lactâmicos foram obtidas pela técnica de diluição em ágar.
4.2.1 - Preparo do Inóculo Bacteriano
Após o crescimento em placas de ágar sangue por 18 horas, para a garantia da viabilidade e da pureza das amostras, com o auxílio de alça de semeadura, 3 a 5 colônias isoladas de cada amostra de E. cloacae foram transferidas para tubos contendo 4 ml de salina (NaCl - Sigma, St. Louis, MO). A suspensão bacteriana foi homogeneizada e a turvação medida em
turbidímetro digital (Baxter®, Sacramento, EUA), para a obtenção de uma concentração bacteriana em torno de 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC)/ml correspondente a 0,5 da escala de MacFarland (CLSI, 2006).
4.2.2 - Difusão em Disco
Após o preparo do inóculo (item 4.2.1), a semeadura das amostras de E. cloacae foi feita em placa de ágar Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com auxílio de swab estéril. O perfil de sensibilidade foi realizado utilizando discos de amoxacilina/ácido clavulânico (30µg), piperacilina/tazobactam (110µg), cefoxitina (30µg), ceftriaxona (30µg), cefotaxima (30µg), ceftazidima (30µg), cefepima (30µg), aztreonam (30µg), imipenem (10µg), meropenem (10µg), ertapenem (10µg), amicacina (30µg), cloranfenicol (30µg), ciprofloxacina (5µg), sulfametoxazol/trimetoprim (25µg) e tetraciclina (30µg) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra). As placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC por 18 a 24 horas. Após este período, a leitura foi feita e os halos de inibição interpretados de acordo com os critérios de sensibilidade para enterobactérias estabelecidos pelo CLSI (CLSI, 2007).
4.2.3 - Diluição em Ágar
As CIMs foram obtidas pela metodologia de diluição em ágar seguindo as recomendações do CLSI (CLSI, 2006) para os seguintes β-lactâmicos e respectivas diluições: cefotaxima (0,03-256 µg/ml), ceftazidima (0,03-256 µg/ml), cefepima (0,03-256 µg/ml), imipenem (0,03-32 µg/ml), meropenem (0,03-32 µg/ml) e ertapenem (0,03-32 µg/ml). Esta metodologia foi realizada
por meio da incorporação de concentrações seriadas e logarítmicas do respectivo antimicrobiano em placas individuais de Petri contendo ágar Müeller- Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra). Cada placa representava uma única concentração do antimicrobiano. Foram testadas diferentes concentrações, variando de acordo com o antimicrobiano testado.
Após a preparação e diluição do inóculo (item 4.2.1), foi feita uma nova diluição 1:10, e em seguida as amostras bacterianas foram inoculadas simultaneamente sobre a superfície do ágar utilizando o multi-inoculador, o qual dispensa de 1 a 3 μl contendo aproximadamente o inóculo final de 1 x 104
UFC/ml. As placas inoculadas foram incubadas por 18-24 horas, a 35°C. Após este período, a CIM foi determinada como a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano (CLSI, 2006).
Como controle de qualidade dos testes de susceptibilidade foram utilizadas as cepas da American Type Culture Collection (ATCC): Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Escherichia coli ATCC 25922. As amostras foram classificadas como sensíveis (S), intermediárias (I) ou resistentes (R) aos antimicrobianos testados, de acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI (CLSI, 2007).
4.3 - Avaliação da Similaridade Genética pela Técnica de
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Para a avaliação da similaridade genética entre as amostras de E. cloacae incluídas neste estudo, foi utilizada a análise do DNA cromossômico após digestão enzimática (Tenover et al., 1995). Para cada amostra foi preparada uma suspensão bacteriana em tubos contendo 4 ml de TSB (Oxoid,
Basingstoke, Inglaterra). Após 18-24 horas de incubação a 37°C, os tubos foram centrifugados por 15 minutos. Em seguida, o centrifugado foi diluído em 1 ml de solução salina (NaCl - Sigma, St. Louis, MO) e transferido para um tubo de microcentrífuga de peso conhecido. Os tubos foram centrifugados a 15.000 rpm utilizando microcentrífuga Centrimícro® (Fanem, São Paulo, Brasil) por aproximadamente 30 segundos e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e descartado. Com a finalidade de se determinar o peso do centrifugado, os tubos foram novamente pesados. O centrifugado foi diluído em salina na proporção de 1:1 (o volume da salina em µl foi equivalente ao peso do centrifugado em µg). Um volume de 5 µl desta suspensão foi transferido para outro tubo, onde foi acrescentado 300 µl da solução tampão TEN (Tris 100 mM; pH 7,5; EDTA 100 mM; NaCl 150 mM; água destilada). Essa nova solução foi homogeneizada e misturada com 340 µl de agarose low melt (FMC, Rockland, USA) para a formação de pequenos blocos de géis contendo o DNA cromossômico (plugs). Os blocos foram incubados por um período mínimo de 5 horas em solução EC (Tris 6 mM; pH 7,5; NaCl 1 M; EDTA 0,01 mM; Brj 58 0,5%; Sarcosil 0,5%; Deoxicolato 0,2% e água destilada) a 37ºC. Em seguida os plugs foram incubados a 50ºC, em 2 ml de solução ES (EDTA 0,4 M; pH 9,3; Sarcosil 1,0%) contendo 20 mg/ml de proteinase K (Invitrogen, Germany) numa proporção de 1:1 (2 mg de proteinase K para 2 ml de ES), durante 12 horas. Após este período de incubação, os blocos foram lavados 4 vezes com solução CHEF-TE (Tris 0,1 M; pH 7,5; EDTA 0,1 M) e armazenados nessa solução até serem submetidos a digestão enzimática.
Foram realizados 4 lavagens de 60 minutos cada com tampão DNS (MgCl 1 M; Tris 1 M; pH 8.0; água destilada) antecedendo a digestão
enzimática. O DNA bacteriano foi digerido utilizando 10U por amostra da enzima de restrição SpeI (New England Biolab, Inc., Beverly, Mass, USA), e incubado por 12-18 horas à temperatura de 37ºC. A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1%, em TBE 0,5x (Tris 0,089 M, Ácido Bórico 0,089 M e EDTA 0,002 M), no sistema CHEF-DR III (BioRad Laboratories, Califórnia, EUA) à temperatura de 13oC e utilizando corrente elétrica de 200 volts (6 V/cm). Os padrões de variação de corrente elétrica (switch time) variaram de 5 a 60 segundos e a corrida eletroforética durou 23 horas. O gel foi corado com brometo de etídio 0,08 μl/ml por uma hora, descorado em água destilada por mais uma hora e fotografados sob luz UV.
De acordo com os critérios de Tenover e colaboradores (1995) foram consideradas idênticas todas as amostras que apresentaram perfil eletroforético idêntico entre todas as bandas. Foram consideradas semelhantes (subtipos) e pertencentes a um mesmo clone as amostras que apresentaram diferenças no perfil eletroforético de até seis bandas. As amostras que apresentaram sete ou mais bandas discordantes foram consideradas amostras distintas. Além disso, fotos obtidas dos géis de PFGE foram analizadas pelo programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Em todas as imagens, a definição de bandas foi realizada automaticamente pelo programa e depois conferida individualmente, por comparação visual. O coeficiente de similaridade utilizado foi o coeficiente de Dice (Dice, 1945). O dendograma foi construído utilizando o algorítimo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method using arithmetic averages) (Sneath & Sokal, 1973). Os valores de otimização e tolerância utilizados para o conjunto de isolados foram de 1,0 e 2,0%, respectivamente. Amostras com coeficiente
de similaridade acima de 80% foram consideradas como pertecentes ao mesmo clone (cluster).
4.4 - Avaliação dos Mecanismos de Resistência
4.4.1 - Detecção Fenotípica da Produção de β-Lactamases pela Metodologia de Aproximação em Disco
Todas as amostras foram submetidas à técnica de aproximação em disco modificada a partir da metodologia descrita por Jarlier e colaboradores (1988), para a detecção fenotípica da produção de ESβL. Após o preparo do inóculo bacteriano (item 4.2.1), os testes fenotípicos foram realizados conforme as recomendações do CLSI para teste de difusão em disco (CLSI, 2007). Discos de cefepima (30 µg), ceftriaxona (30 µg), aztreonam (30 µg) e ceftazidima (30 µg) (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) foram dispostos de 15 a 25 mm (centro a centro) do disco de amoxacilina/ácido clavulânico (30 µg), colocado no centro da placa, conforme ilustrado na Figura 3.
15-25 mm
AMC FEP
ATZ CAZ
CRO
Figura 3. Placa modelo utilizada para a detecção fenotípica da produção de ESβL. Abreviações: CAZ - ceftazidima; CRO - ceftriaxona; FEP - cefepima; ATZ - aztreonam; AMC - amoxacilina/ácido clavulânico.
A visualização de distorções nos halos ou formação de zonas fantasmas para qualquer um dos substratos utilizados foi considerada como resultado positivo. Como controles positivos e negativos foram utilizados cepas de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 e Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, respectivamente.
4.4.2 - Teste Fenotípico de Indução de β-Lactamase do Tipo AmpC
Para a avaliação fenotípica da indução da β-lactamase do tipo AmpC entre as amostras de E. cloacae foi realizada o teste de indução modificado a partir da metodologia descrita por Dunne e Hardin (2005). Em placas de ágar Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), como descrito no item 4.2.1, foram dispostos discos de imipenem (10 µg) e cefoxitina (30 µg), dois fortes indutores de AmpC, a uma distância de 15 a 25 mm (centro a centro) do disco de ceftazidima (30 µg), como mostrado na Figura 4. O achatamento do halo de ceftazidima foi considerado como resultado positivo.
15-25 mm
FOX CAZ
IPM
Figura 4. Placa modelo utilizada para a detecção fenotípica da indução de AmpC. Abreviações: CAZ - ceftazidima; FOX - cefoxitina; IMP - imipenem.
4.4.3 - Teste de Hidrólise Enzimática
O teste de hidrólise teve como objetivo principal à detecção da atividade enzimática nas amostras analisadas. Depois de isoladas as amostras, 10 colônias foram inoculadas em 10 mL caldo de TSB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com 4 μg/mL de ceftazidima. Os tubos ficaram incubados na estufa a 37°C por 18 horas sob agitação. A suspensão bacteriana foi transferida para um tubo cônico e passou por uma centrifugação de 15 minutos à 3.000 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em 1 ml de Solução de Hidrólise (Tris-HCL 1 mM e ZnSO4 1 mM). As amostras suspensas foram
ultrasonicadas com 4 ciclos de 30 segundos e o produto sonicado foi transferido para tubo de microcentrífuga e, então, centrifugado por 3 minutos à 4ºC e 13.000 rpm (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Germany). O sobrenadante (extratos brutos de proteínas) foi transferido para um novo tubo e as amostras mantidas no gelo até o momento do ensaio (Bradford et al., 1994).
Uma solução de cefepima em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0 foi utilizada como substrato. Quando colocada em espectrofotômetro, esta solução teve uma absorbância de aproximadamente 1,5 a 2 unidades em comprimento de 260 nm. Para o teste, colocou-se 900 μl desta solução em uma cubeta de quartzo onde foram adicionados 100 μl do extrato bruto de β-lactamase. O monitoramento da absorbância da solução foi realizado por 1 minuto em espectrofotômetro. Presença da diminuição da absorbância foi considerada resultado positivo para a produção de β-lactamases. Uma solução de ácido clavulânico também foi preparada, como descrita anteriormente, para a detecção da produção de possíveis ESβLs. 100 μl dessa solução foi misturada a 800 μl de solução de cefepima e em seguida adicionada 100 μl do extrato
bruto de β-lactamase. Ausência da dimuição da absorbância na presença do ácido clavulânico foi considerado como teste confirmatório da presença de ESβLs.
4.4.4 - PCR para a Detecção dos Genes Codificadores de β- Lactamases
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi aplicada para confirmar a presença ou ausência dos genes que codificam as β-lactamases. As amostras foram cultivadas em ágar nutriente (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) contendo de 0,5 µg/ml de ceftazidima e, após isolamento de colônias puras, 3 a 5 colônias de cada amostra foram transferidas para um tubo de microcentrífuga contendo 200 µl de água destilada estéril. Esta suspensão foi utilizada diretamente para a etapa de amplificação do DNA. Em fluxo laminar, foi preparada uma solução mãe (master mix) contendo: H2O
deionizada estéril, tampão MgCl2 1,5mM, tampão NH4Cl 50mM,
desoxinucleotídeo trifosfato 0,2mM (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 2,5 unidades/L de Taq DNApolimerase e iniciadores de reação na concentração de 2 µM.
Foram utilizados iniciadores de reação para a detecção dos genes codificadores das seguintes β-lactamases: ESβLs (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M,
blaBES); MβLs (blaIMP, blaVIM, blaSPM), enzimas da Classe A (blaKPC, blaGES); e
AmpC plasmidiais (blaCMY-1, blaCMY-2, blaDHA, blaFOX), como mostrado na Tabela
Tabela 2. Gene alvo e oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a detecção dos genes codificadores de β-lactamases.
Gene Alvo Iniciador Seqüência (5' - 3')
TEM F ATGAGTATTCAACATTTCCG blaTEM TEM R CTGACAGTTACCAATGCTTA SHV F GGTTATGCGTTATATTCGCC blaSHV SHV R TTAGCGTTGCCAGTGCTC CTX-M F CGCTTTGCGATGTGCAG blaCTX-M CTX-M R ACCGCGATATCGTTGGT BES F GGCGCAATACAACGAAGG blaBES BES R ATCTTGCAGTACCAGTCG IMP F TGAGCAAGTTATCTGTATTC blaIMP IMP R TTAGTTGCTTGGTTTTGATG VIM F TTATGGAGCAGCAACGATGT blaVIM VIM R CAAAAGTCCCGCTCCAACGA SPM F CGCTGCGAACGTGAGTGTAA blaSPM SPM R CGATCGCGGCCTATGTTTGA KPC F TCGCTAAACTCGAACAGG blaKPC KPC R TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC GES F TCACGCACTATTACTGGC blaGES GES R TATTTGTCCGTGCTCAGG CMY-1 F CGACAATCCATCCTGTGG blaCMY-1 CMY-1 R CCAACTGCGCCAGGATG CMY-2 F TCGTTATGCTGCGCTCTG blaCMY-2 CMY-2 R GGACAGGGTTAGGATAGC DHA F CACTGATTTCCGCTCTGC blaDHA DHA R AGCCTGTGCAGCTTTGAC FOX F ATGCAACAACGRCGTGC blaFOX FOX R TCACTCGGCCAACTGACTCAG
Para a detecção da produção de β-lactamases do tipo oxacilinases foi utilizado a metodologia de PCR-multiplex descrita por Woodford e colaboradores (2006). Todos os primers utilizados foram desenhados no Laboratório Alerta e posteriormente encaminhados para síntese (IDT - Integrated DNA Tecnologies Inc., Coralville, EUA). A solução-mãe foi mantida a aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação 19 μl foram
transferidos para cada tubo de amplificação, contendo 1 μl da suspensão celular.
As condições para amplificação do DNA foram: denaturação a 94ºC por 10 minutos, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a 72ºC. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado foi feita em eletroforese em gel de agarose a 1% e visualização sob luz ultra-violeta.
Além da detecção de β-lactamases, foi realizado também PCR para a detecção de integrons entre os isolados de E. cloacae, utilizando os primers Int F (5’-CCGTAGAAGAACAGC-3’) e Qac R (5’-GTTGCGATTACTTCG-3’). As condições para amplificação do DNA foram: denaturação a 94ºC por 10 minutos, seguidos por 36 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 52ºC por 30 segundos, 72ºC por 10 minutos. A etapa de extensão final foi realizada por 10 minutos a 72ºC.
4.4.5 - Reação de Seqüênciamento e Interpretação dos Resultados
Os produtos de PCR obtidos foram purificados a partir do gel de agarose com o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Alemanha), conforme as instruções do fabricante. O DNA obtido foi quantificado utilizando o espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra) e, então, quantidades necessárias foram submetidas à reação preparatória para o seqüênciamento com o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA). Após o término da reação de PCR, o produto foi precipitado para a eliminação dos d-dNTPs marcados
não incorporados à reação. Após a precipitação e lavagem com etanol, o produto foi ressuspenso em polímero TSR e colocado no aparelho ABI PRISM 310, Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Califórnia). As seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas foram analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR, Madison, WI) e então submetidas a comparação com bases de dados genéticos disponíveis na internet (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/ e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
4.4.6 - Avaliação fenotípica da expressão de Bombas de Efluxo
Para avaliação fenotípica da presença de bombas de efluxo, CIMs foram determinadas para os antimicrobianos cefepima, imipenem, meropenem e ertapenem, nas mesmas concentrações citadas no item 4.2.3, ao ágar Müeller- Hinton (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) na ausência e na presença dos inibidores de bomba de efluxo reserpina e fenilalamida arginina β-nafitilamida - PAβN (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, EUA), em concentrações fixas de 20 e 25 µg/ml, respectivamente (Gayet et al., 2003). A diminuição da CIM ≥ 2 diluições para a associação β-lactâmico/inibidor em relação à CIM do β- lactâmico sozinho foi considerada indicativa da hiperexpressão de bomba de efluxo, segundo a metodologia de diluição em ágar (CLSI, 2006).
4.4.7 - Avaliação do Perfil das Proteínas de Membrana Externa
Com auxílio de uma alça estéril e em fluxo laminar, de 3 a 5 colônias bacterianas foram inoculadas em 5 ml de caldo TSB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) acrescido de 0,5 µg/ml de ceftazidima e incubadas sob leve agitação
a 37°C por 18 a 20 horas. Após este período, em fluxo laminar, 5 ml desta cultura foi transferido para outro tubo contendo 45 ml de TSB, o qual foi incubado por 4 a 5 horas a 37°C. Em seguida as células bacterianas foram centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi descartado o sobrenadante e o centrifugado ressuspenso em 5 ml de Tris- HCl 30 mM pH 8.0. Após a suspensão das células, as mesmas foram centrifugadas a 8.000 rpm por 10 minutos, suspensas novamente em 5 ml de Tris-HCl 30 mM pH 8.0 e lisadas por sonicação (6 pulsos de 10 segundos cada) em sonicador XL2000 Ultrasonic Cell Disruptor-Fisher (Scientific International Inc.). Durante o processo as amostras foram mantidas em gelo. Em seguida, a suspensão de células foi centrifugada a 8.000 rpm por 25 minutos a 4°C para a remoção dos debris celulares. O sobrenadante foi submetido à centrifugação de 38.200 rpm por 34 minutos a 4°C, em ultracentrífuga Hitachi Himac CP85β utilizando o rotor fixo P55AT (Hitachi Koki Corp. Tokio, Japão). Em seguida, o precipitado foi suspenso em 1 ml de Tris- HCl 30mM pH 8.0 e, após a suspensão, 100 μL de sarcosil a 20% foi adicionado para que as OMPs fossem precipitadas. Após cuidadosa agitação, este precipitado foi incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, foi realizada uma nova etapa de centrifugação a 38.200 rpm por 34 minutos a 22°C e, finalmente, o precipitado suspenso em 100 μL de água deionizada. Os preparados protéicos foram submetidos à análise do perfil de proteínas de membrana externa pela técnica de SDS-PAGE.
Na técnica de SDS-PAGE, as amostras e os padrões de peso molecular foram aplicadas no gel de dodecil sulfato de sódio (SDS), contendo 12% (pt/vol) de acrilamida (SDS-PAGE 12%). A eletroforese foi realizada a 40 volts
por 2 horas no sistema V-16 Vertical Gel Electrophoresis System (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, EUA). Após a corrida eletroforética, o gel foi corado durante uma hora com coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, EUA). Como descorante foi utilizado ácido acético a 10%. A análise do gel foi feita com o programa Gel Doc-Quantity one (BioRad, California, EUA).
4.4.8 - Análise dos Níveis de Transcrição dos Genes ampC, ompC e ompF pela Técnica de PCR em Tempo Real (qRT -
PCR)
A técnica de qRT-PCR foi utilizada para a quantificação dos níveis de transcrição dos genes ampC, ompC e ompF, com o intuito de verificar alterações da permeabilidade de membrana externa (expressão das porinas OmpC e OmpF) e a hiperexpressão de β-lactamase cromossomal do tipo AmpC. Para a realização das reações foram utilizados os inciadores mostrados na Tabela 3:
Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a quantificação dos genes ampC, ompC e ompF pela técnica de qRT-PCR. .
Gene Alvo Iniciador Seqüência (5' - 3')
AmpC F TGGCAGCCGCAGTGGAAGC ampC AmpC R ATAGGGCATGCCAGAAGGTTTGA OmpC F ACTTCGGCCTGCGTCCATCC ompC OmpC R TAGTAAGTCGCACCCACATCAACAT OmpF F CGGCGCGACTTACTACTTCA ompF OmpF R ATGCCCAGCTTGTTGTCGTCTTTCA
As amostras bacterianas foram cultivadas por 18-24 horas em caldo TSB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), posteriormente diluídas em uma cultura fresca 1:100 e incubadas a 37ºC até a fase exponencial de crescimento (0,6 de absorbância), medido em espectrofotômetro Biomate 5 UV-Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra). Um volume de 1 ml da cultura bacteriana foi centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4°C e o centrifugado resultante foi mantido congelado a -70 ºC, se necessário para posterior utilização. O centrifugado foi lavado com 500 µl de água destilada estéril e centrifugado a 13.000 rpm por um minuto. Para a ressuspensão do centrifugado foram utilizados 100 µl de TE e em seguida tratada com 2 µl de lisozima (20 mg/ml). A extração do RNA total foi feita com a utilização do kit RNeasy Mini Kit (Invitrogen, Califórnia, EUA) como descrito pelo fabricante. O DNA genômico foi eliminado utilizando DNase I (Rnase-Free Dnase Set - QIAGEN, Hilden, Germany). Para a síntese do DNA complementar (cDNA) foram utilizados 20 ng do RNA total medido em espectrofotômetro a um comprimento de onda igual a 260 nm e o Kit High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Califórnia, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. A PCR quantitativa foi processada em termociclador CFD-3220 DNA Engine Opticon 2 Two-Color Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, Califórnia, EUA) numa reação contendo 10 µM/µl de inciadores específicos para cada gene, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), Taq Dna Polimerase (Invitrogen) e o produto da reação de síntese de cDNA 1:10. Foi realizado um ciclo de 15 minutos a 50ºC, 5 minutos a 95ºC para a desnaturação e 40 ciclos de amplificação por 20 segundos a 95ºC, anelamento por 20 segundos a 52ºC e extensão por 1 minuto a 72ºC. As taxas de transcrição dos respectivos genes
foram comparados ao gene de referência que codifica a porção da subunidade 16S do RNA ribossomal (rrsE). Avaliações comparatórias foram realizadas entre as amostras bacterianas do estudo frente a cepa sabidamente sensível aos β-lactâmicos de estudo, sendo utilizada a cepa de E. cloacae 13.412.
5 - RESULTADOS
5.1 - Perfil de Susceptibilidade aos Antimicrobianos
Como observado na Tabela 4, todas as amostras de E. cloacae estudadas foram resistentes a cefoxitina, cefalosporinas de terceira geração (ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima), cefepima, aztreonam e as associações com inibidores de β-lactamases (piperacilina/tazobactam e amoxacilina/ácido clavulânico) pela técnica de difusão em disco. Somente imipenem e meropenem apresentaram 100% de atividade entre os β-lactâmicos estudados. Entretanto, 72% (n=8) das amostras foram resistentes a ertapenem, sendo que das três amostras restantes, duas apresentaram resistência intermediária. Entre as demais classes de antimicrobianos avaliadas, uma alta taxa de resistência também foi observada para ciprofloxacina (100%), amicacina (63,4%) e sulfametoxazol/trimetoprim (63,4%). Entre os isolados testados, 100% foram resistentes a tetraciclina, e destes 45,45% (5/11) foram também resistentes ao cloranfenicol.
Tabela 4. Perfil de susceptibilidade entre os isolados de E. cloacae pela técnica de difusão em disco.
Categoria de Sensibilidadea Amostras