A forma natural como as agrobactérias são capazes de transferir sequências definidas de DNA (T-DNA) para a genoma da célula vegetal, através de funções codificadas pelos genes vir dos plasmídios Ti do Agrobacterium tumefaciens e Ri do A. rhizogenes, tem sido largamente explorada no desenvolvimento de vectores de transformação. No plasmídio Ti, a região vir actua na configuração cis ou trans em relação ao T-DNA, o que permitiu que fossem desenvolvidos dois sistemas de vectores desarmados: a) vector co-integrado, baseado na actuação em cis dos genes vir, em que os genes de interesse são inseridos por recombinação homóloga no T-DNA presente no plasmídio Ti (Zambryski et al., 1983); b) vector binário, baseado na actuação em trans dos genes vir, em que o T-DNA e a região vir se encontram em dois plasmídios diferentes (Hoekema et al., 1983). No vector binário está presente uma origem de replicação funcional na bactéria A. tumefaciens e os genes de interesse são clonados entre as sequências flanqueadoras LB (“left border”) e RB (“right border”) do T-DNA. Por seu lado, a bactéria A. tumefaciens deve conter um plasmídio Ti com uma região vir intacta (plasmídio “helper”), ao qual falta a região T-DNA (Hoekema et al., 1983). Os vectores binários têm ainda a particularidade de serem facilmente introduzidos e replicados, quer em Escherichia coli, quer nas agrobactérias (Bevan, 1994).
No T-DNA encontra-se geralmente um gene de selecção, por exemplo o nptII, que confere resistência a um antibiótico e um gene repórter, com a função de identificar as células transformadas. Utilizado pela primeira vez por Jefferson et al. (1986), o gene uidA da E. coli que codifica para a -glucuronidase, tornou-se no gene repórter mais utilizado nos ensaios de transformação genética. A presença de promotores e terminadores fortes, tais como os do gene nos (“nopaline synthase”) e os do vírus “cauliflower mosaic virus” (CaMV), são elementos importantes para uma transformação eficiente em plantas dicotiledóneas e asseguram que os genes de interesse clonados no T-DNA sejam expressos na célula hospedeira (Huttner, 1992).
No presente trabalho foi usado o vector binário pBI121 (Clontech, ref. 6018-1) de 13 Kb que contém o T-DNA delimitado pelas sequências flanqueadoras LB e RB, com
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a região codificante para o gene nptII e a região codificante para o gene uidA. O T-DNA foi modificado com a inserção da cassette pE7113 que transporta o gene da proteína do capsídio (CP). A cassette pE7113, gentilmente cedida pelo Dr. Masashi Ugaki (Nat. Inst. Agrobiological Resources, Ibaraki, Japan) contém duas sequências reguladoras: o “enhancer” E7 e a sequência que aumentam a eficiência da tradução em células vegetais (Mitsuhara et al., 1996). A sequência e o gene da CP ficaram delimitados pelo promotor 35S do CaMV e pelo terminador nos da nopalina sintase (Fig. 4.2-d).
4.2 – PREPARAÇÃO DO VECTOR DE TRANSFORMAÇÃO
A partir de um isolado do CTV foi amplificado o gene da CP para ser posteriormente inserido na cassette pE7113, em substituição do gene uidA. A cassette pE7113-CP foi posteriormente excisada do plasmídio pUC18 e inserida no T-DNA do plasmídio pBI121, em substituição da região codificante do gene uidA.
Isolamento e clonagem do gene da CP no vector pCRII
O gene da CP foi isolado e clonado no vector pCRII segundo o esquema da Fig. 4.1. Para a amplificação do gene da CP foi usado o isolado 78 (planta 25) com características “mild” (ver Tabela 2.1). O gene foi amplificado por IC/RT-PCR com os “primers” CTV11 e CTV10, originando um fragmento de 689 pb que corresponde ao gene da CP com 16 nucleótidos adicionais na extremidade 5´ e um nucleótido adicional na extremidade 3´. O “primer” CTV11 apresenta um local de restrição da enzima Bam HI (Amersham Biosciences, Ref. 27-0868-03) (Fig. 4.1-A). O gene da CP foi ligado no vector pCRII por TA Cloning (Fig. 4.1-B). Após a confirmação da ligação por PCR, procedeu-se à extracção e purificação do DNA plasmídico pelo Kit “WizardPlus Minipreps”. A dimensão do fragmento de DNA inserido foi em seguida confirmada por digestão com a enzima Eco RI (Fig. 4.1-C). A análise da orientação do gene da CP no plasmídio pCRII foi feita por digestão enzimática com a enzima Bam HI. A presença de um local de restrição da Bam HI no plasmídio pCRII no local múltiplo de clonagem (“multiple cloning site”) e de um outro local de restrição situado no gene da CP clonado, inserido pelo “primer” CTV11, permitiu saber a orientação do inserto (Fig. 4.1-C). A partir de um clone com o gene da CP na orientação correcta, foi feita uma amplificação por PCR com os “primers” CTV 11 e CTV16. Este novo “primer” CTV16 hibrida, na extremidade 3´, com o gene da CP e na extremidade 5´ com o plasmídio pCRII. Com este “primer” foi adicionado um local de restrição Sac I (Amersham Biosciences, ref. 27-0970-01) à sequência amplificada (Fig. 4.1-D). O produto da amplificação por PCR foi digerido simultaneamente com as enzimas de restrição Bam HI e Sac I (Fig. 4.1-E), libertando o gene da CP com 673 pb, que corresponde ao gene da CP, o codão de terminação e um nucleótido extra na extremidade 3’ (Fig. 4.1-F). O
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gene da CP com extremidades coesivas foi isolado do gel de agarose pelo kit “Sephaglas BandPrep” e purificado pelo kit “MicroSpin Columns”.
Clonagem do gene da CP na cassette pE7113
A clonagem do gene da CP na cassette pE7113 e a clonagem desta cassette no plasmídio pBI121 estão esquematizados na Fig. 4.2. A cassette pE7113, inserida no plasmídio pUC18, foi digerida com as enzimas Bam HI e Sac I para libertar o gene uidA (Fig. 4.2-a). Os fragmentos resultantes (pUC18-pE7113 e o gene uidA) foram separados por electroforese em gel de agarose a 0,7% em tampão TAE. O fragmento pUC18- pE7113 foi recuperado da agarose utilizando o kit “Sephaglas BandPrep” e purificado pelo kit “MicroSpin Columns”. O gene da CP foi ligado na cassette pE7113, segundo o protocolo referido em 2.8.1. A presença do inserto na cassette foi verificada por digestão com as enzimas de restrição Bam HI e Sac I e o resultado analisado em gel de agarose a 0,7%.
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Fig. 4.1 –Esquema da clonagem do gene da CP no vector pCRII.
Abreviaturas: p25 (CP)= gene da proteína do capsídio do CTV; LMC= local de múltipla clonagem. pCRII Eco RI Eco RI p25 (CP) (689 pb) p25 (CP) pCRII p25 (CP) Bam HI
a) Amplificação do gene da CP por IC/RT-
PCR com os “primers” CTV11/CTV10. O “primer” CTV11, a montante, insere um local de restrição da Bam HI, esquematizado na figura com o traço azul escuro.
b) Clonagem do gene da CP no plasmídio
pCRII. O gene fica flanqueado pelo
local de múltipla clonagem (LMC), onde se encontram sequências de restrição de várias enzimas.
c) Na digestão com a enzima de restrição Eco RI libertou-se o gene da CP.
d) A digestão com a enzima Bam HI
permitiu saber a orientação do inserto.
e) O gene da CP inserido na posição
correcta é amplificado por PCR com os “primers” CTV11/CTV16. O “primer” CTV16 insere um local de restrição da enzima Sac I, esquematizado na figura com o traço azul escuro.
f) A digestão com a enzima Bam HI e Sac I
liberta o gene da CP com 673 pb.
Bam HI LMC LMC LMC LMC pCRII p25 (CP) CTV11 CTV16 Sac I LMC LMC Bam HI p25 (CP) p25 (CP) (673 pb) A B C D E F
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Clonagem da cassette modificada pE7113-CP no plasmídio pBI121
A cassette pE7113 modificada com a inserção do gene da CP do CTV, foi excisada do plasmídio pUC18 com as enzimas de restrição Eco RI e Hind III (Fig. 4.2- b). A cassette pE7113-CP foi extraída da agarose usando o sistema Biometra Transiluminator e foi purificada por precipitação com acetato de sódio/etanol.
O plasmídio pBI121 foi também sujeito a uma digestão com as enzimas de restrição Eco RI e Hind III, para libertar o fragmento constituído pelo gene uidA, promotor 35S e terminador 35S (Fig. 4.2-c). O fragmento restante do pBI121 foi isolado e extraído do gel de agarose a 0,7% pelo método referido acima, seguido de uma purificação por precipitação com acetato de sódio/etanol. A cassette pE7113-CP foi então ligada no plasmídio pBI121 (Fig. 4.2-d), de acordo com o protocolo referido em 2.8.1.
Fig. 4.2 – Esquema da modificação do T-DNA do plasmídio pBI121. Abreviaturas: nos-Pro; promotor do
gene da nopalina sintase; nos-Ter: sequência de terminação do gene da nopalina sintase; 35S-Pro: promotor do vírus do mosaico da couve-flor; nptII (CanR), gene que codifica para a neomicina fosfotransferase e que confere resistência à canamicina; uidA: gene que codifica para a enzima - glucuronidase; E7: “enhancer”; : sequência formada por 25 repetições da sequência CAA; p25 (CP): gene da proteína do capsídio do CTV.
E7 35S-Pro B am HI Sac I p25 (CP) B am HI Sac I p25 (CP) E7 35S-Pro
(b) Cassette pE7113-CP (plasmídio pUC18)
nos-Pro npt II (CanR
) nos-Ter 35S-Pro uidA nos-Ter
LB RB Hind I II Hind I II E co R I
(c) T-DNA do pBI121 - Cassette GUS (a) Cassette pE7113 (plasmídio pUC18)
nos-Pro npt II (CanR
) nos-Ter E7 p25 (CP) nos-Ter
LB RB
35S-Pro
(d) Cassette 7113-CP (plasmídio pBI121)
1,8 Kb nos-Ter uidA nos-Ter Hind I II E co R I Hind I II E co R I
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Procedeu-se à transformação de células bacterianas de E. coli InvF´ com o plasmídio pBI121-pE7113-CP, que foi transferido para a bactéria A. tumefaciens, estirpe EHA105, após conjugação triparental.
4.3 - TRANSFORMAÇÃO DE UMA PLANTA MODELO, Nicotiana tabacum
A expressão do gene da CP do T-DNA modificado com a construção pE7113-CP foi testada através da transformação de uma planta modelo, Nicotiana tabacum. A partir de plântulas de N. tabacum mantidas in vitro no meio de cultura RMIN, cortou-se tecido foliar que foi usado no processo de transformação. No método de transformação seguido, dos discos foliares, usou-se a bactéria A. tumefaciens, estirpe EHA105 com o plasmídio pBI121-pE7113-CP.
Os numerosos rebentos adventícios obtidos em meio de regeneração a partir de cada secção foliar (Est. I-A), foram transferidos para meio RMIN para o desenvolvimento radicular e caulinar das plantas (Est. I-B). Após 3 a 4 meses de crescimento no meio RMIN, as plantas foram envasadas e adaptadas às condições ex vitro (Est. I-C).