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A contracepção confiável é uma das principais conquistas do último século, particularmente para as mulheres. Cerca de 100 milhões de mulheres em todo o mundo usam contraceptivos na forma de pílula. Além da contracepção, o uso da pílula tem

benefícios terapêuticos para muitas desordens ginecológicas, por exemplo, dismenorréia, sangramentos irregulares e excessivos, acne, endometriose e, sobretudo, reduz a incidência de anemia por deficiência de ferro (DHONT, 2010). No entanto, não há dúvidas de que o estrógeno aumenta de 2 a 4 vezes o risco de tromboembolismo e estudos epidemiológicos mostram que o efeito do estrógeno é modulado pelo tipo de progestagênio associado (VAN HYLCKAMA et al., 2009).

Desde o advento da pílula há 50 anos, há uma busca constante para minimizar os efeitos colaterais indesejáveis dos contraceptivos hormonais, caracterizada pela redução das doses de hormônios, diferentes combinações de progestagênios com estrogênio e o desenvolvimento de vias alternativas de administração. Esta evolução foi e é facilitada pelos avanços no conhecimento dos mecanismos hormonais e monitoramento dos efeitos metabólicos e endócrinos elucidados pelos contraceptivos (DHONT, 2010).

Em virtude do crescente interesse científico nas interações entre o sistema complemento (SC), a hemostasia e o uso de contraceptivos hormonais, nesse estudo nós investigamos o efeito do uso de diferentes contraceptivos hormonais combinados (CHC) sobre o sistema complemento.

As atividades biológicas do SC são mediadas por produtos gerados durante a sua ativação. Os receptores para complemento (CR) reconhecem produtos de ativação, como C3b, depositados nas superfícies estranhas, promovendo lise, fagocitose e/ou

clearance. Já os peptídeos quimiotáticos (C3a, C4a e C5a) favorecem a resposta

inflamatória (RICKLIN et al., 2010).

Esta investigação abordou o efeito do uso dos CHC sobre diferentes funções do sistema complemento: a capacidade dos receptores para complemento (CR) mediarem a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) dos neutrófilos (burst oxidativo); a capacidade opsonizante do soro, para estimular os CR nos neutrófilos; a atividade hemolítica do complemento sérico; os níveis séricos e atividade funcional do inibidor de C1 e a geração de produtos de ativação do SC.

Primeiramente nós analisamos a capacidade dos CR (CR1 e CR3) nos neutrófilos de usuárias de CHC responderem ao estímulo opsonizado com fragmentos do complemento de soro humano normal. Para esta análise, nós estimulamos os neutrófilos das voluntárias de CHC com zimosan opsonizado com pool de soro de

voluntárias não usuárias de CHC. Neste modelo, a única variável dependente do efeito do CHC é o CR no neutrófilo da usuária de contraceptivo.

O método de quimioluminescência (QL) foi usado para estudar o efeito dos CHC no burst oxidativo dos neutrófilos mediado pelos CR em resposta aos produtos de ativação do SC. A comparação do grupo de mulheres CHC como um todo, sem discriminar os diferentes tipos, com o Grupo Controle não mostrou diferença. No entanto, quando consideramos os diferentes CHC em grupos separados, a produção de ERO apresentou variações entre os grupos, embora não significativas na maioria das análises estatísticas. Houve uma tendência a maior produção de ERO no Grupo 1 (drospirenona + 30g de estrogênio) em relação ao controle. É difícil explicar este resultado, uma vez que os Grupos 2 e 3 compartilham com o Grupo 1 o mesmo progestagênio e a mesma concentração de estrogênio, respectivamente, e não mostraram aumento da QL. Talvez a associação hormonal no Grupo 1 seja a responsável pela tendência ao aumento da produção de ERO.

A geração de ERO pelos neutrófilos é mediada pelas enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidade (MPO), representando um importante mecanismo da imunidade inata contra patógenos (ROSS et al., 2003). Várias evidências mostram que os hormônios esteróides sexuais influenciam o padrão da resposta inflamatória em humanos, em particular, o papel do progestagênio como um imunossupressor natural, que modula negativamente a produção de citocinas pró-inflamatórias nos neutrófilos (CUTOLO et al., 2004). Quando os níveis de progestagênio estão elevados, como na gravidez e na fase lútea do ciclo menstrual, há uma maior suscetibilidade às infecções por Candida

albicans (FIDEL et al., 2000). Chen e colaboradores (2009) relataram o efeito

modulador importante do progestagênio na interação de neutrófilos com cepas de

Neisseria gonorrhoeae causadoras de infecção assintomática. Os autores observaram

que o progestagênio induz um atraso na apoptose de neutrófilos sem contudo alterar o

burst oxidativo.

Quanto ao estrogênio, Babior et al. (1973) demonstraram que o estrogênio aumenta a produção de ânion superóxido por neutrófilos ativados. Também foi descrito que o estrogênio pode liberar MPO dos neutrófilos (KLEBANOFF et al., 1977). Estas observações podem explicar o aumento da resposta de QL dos neutrófilos causada pelo estrogênio descrita por Jansson (1991), que implica na liberação de MPO. Além disso, Kenneth et al. (2004) mostraram que o estrogênio aumenta a desgranulação (MPO e elastase) e a produção de ânion superóxido, a primeira ERO gerada no burst oxidativo

pelos neutrófilos. O aumento da MPO resultou em aumento da oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL). Esta observação suporta a hipótese da ação benéfica pró- oxidante do estrogênio, uma vez que a oxidação da LDL favorece seu clearance e, consequentemente, contribui para a prevenção da doença cardiovascular.

Assim, a tendência ao aumento da QL observado no Grupo 1 pode refletir um efeito da maior concentração de estrogênio (30g) comparada aos outros grupos e não ser influenciada pelo progestagênio. Embora, o Grupo 3 também tenha a mesma concentração de estrogênio, o número de amostras (n) foi pequeno. Isto pode ter subestimado o efeito do estrogênio na QL dos neutrófilos desse grupo.

Ainda utilizando o modelo de QL dos neutrófilos, uma segunda abordagem analisou o efeito dos CHC na capacidade opsonizante do soro. Nesta análise, nós comparamos a resposta de QL das usuárias de CHC estimulada por complemento autólogo (SCH) com aquela destas mesmas células estimuladas com complemento do Grupo Controle (SHN). A mesma população de neutrófilos foi comparada com diferentes fontes de complemento. As comparações foram pareadas dentro de cada grupo de CH. O Grupo 4 foi o único que apresentou diferença significativa entre o SHC e o SHN. Nós observamos uma redução na produção de ERO quando os neutrófilos do Grupo 4 foram estimulados com zimosan opsonizado pelo soro autólogo (Zi/SHC). Este resultado pode sugerir uma redução dos níveis séricos do complemento, mas no momento nós não temos dados para suportar esta hipótese. As análises séricas realizadas nesse grupo incluíram somente a atividade hemolítica e a determinação semi- quantitativa do inibidor de C1, sendo que para ambas não observamos diferença em relação ao controle. Desta maneira, esta redução da QL mediada pelo nível sérico do complemento no Grupo 4 permanece a esclarecer.

É importante ressaltar que apesar de todos os efeitos fisiológicos do estrogênio na manutenção das funções reprodutivas e não reprodutivas estes efeitos dependem do tipo celular, do tipo de receptor de estrogênio, da dose e da exposição ao hormônio. O estrogênio também tem sido associado à indução de ERO, as quais podem mediar a ativação de fatores de transcrição para a progressão do câncer (OKOH et al., 2011).

O estrogênio pode também exercer efeitos anti-oxidantes por ação do seu metabólito catecolestrogênio no ciclo de redox do ferro e, então, atuar nos genes com elementos responsivos para anti-oxidantes. Assim, por suas ações anti- e pró-oxidantes

o estrogênio pode produzir ambos efeitos benéficos e adversos importantes na prevenção e na patogênese das doenças (NATHAN; CHAUDHURI, 1998).

Os resultados das respostas de QL dos neutrófilos sugeriu a avaliação da expressão de CR1 e CR3, uma vez que esses eram os receptores envolvidos na produção de ERO pelos neutrófilos estimulados com zimosan opsonizado por complemento. Nós analisamos a densidade da expressão desses receptores na membrana dos neutrófilos, que foi expressa pela intensidade de fluorescência/célula, e pela porcentagem e neutrófilos positivos, ou seja, a % de neutrófilos expressando o receptor na população estudada.

A densidade do CR1 e do CR3 na membrana dos neutrófilos e a % de neutrófilos positivos para CR3 não foram diferentes entre os grupos estudados. Esta observação contribui para o entendimento da resposta de QL, uma vez que não houve diferenças significativas entre os grupos, apesar da tendência de aumento da QL no Grupo 1. No entanto, nós encontramos uma redução significativa da % de neutrófilos expressando CR1 no grupo CH como um todo e nos Grupos 3 e 4, quando comparados ao controle. Este tipo de observação, geralmente, reflete uma característica adquirida. Neste caso, sugere-se que seria adquirida pelo efeito do CH sobre o CR1 no neutrófilo.

O efeito dos hormônios esteróides sexuais na expressão dos CR é pouco explorado e há uma escassez de relatos na literatura. Jansson e Holmdahl (1998) mostraram que a artrite reumatoide (AR) tende a melhorar durante a gravidez, correspondendo com níveis de estrogênio elevados e que este também suprime a AR induzida por colágeno. Nilsson et al. (2009) descreveram um possível papel do estrogênio na expressão do CR1 em um modelo de AR induzida por colágeno em camundongos. Esses autores observaram uma redução da expressão do CR1 em linfócitos B dos camundongos com AR e ovarioectomizados, sugerindo um efeito protetor do estrogênio contra a auto-imunidade. Ainda nesse estudo, os autores compararam a expressão de CR1 nos linfócitos B de homens e mulheres saudáveis. Eles observaram uma redução de CR1 no grupo de mulheres, que foi relacionada com o aumento da idade. Estas observações podem sugerir uma explicação para o aumento da freqüência de AR na pós-menopausa.

Quanto ao CR3, o único trabalho que encontramos na literatura foi realizado por Lamote et al. (2006). Eles investigaram se a ocorrência frequente de mastite em vacas

no final da gestação era influenciada pelos esteróides sexuais. O estudou analisou a viabilidade e a expressão de CR3 em neutrófilos. Nem o estrogênio nem o progestagênio influenciaram a expressão do CR3. Nosso resultado está de acordo com esta observação, uma vez que o CR3 não foi influenciado por nenhum dos CHC estudados.

Até aqui pode ser sugerido que o aumento da QL no Grupo 1 não é devido a alteração da expressão dos CR, mas provavelmente esteja relacionada ao efeito do estrogênio diretamente na liberação da MPO e produção de ERO. Os resultados obtidos apontam para a investigação futura dos mecanismos envolvidos na ativação da NADPH oxidase e da desgranulação dos neutrófilos.

Como já discutido, o tempo de exposição ao estrogênio pode ser determinante dos efeitos deste sobre diferentes órgãos e sistemas no organismo. Isto pode apontar a favor do caráter adquirido na redução de neutrófilos positivos para CR1 nos Grupos 3 e 4. Assim, nossos resultados precisam ser reconsiderados a luz da relação do tempo de uso do CHC e da análise da expressão de CR1.

Na etapa seguinte, nós analisamos a AH do SC medida pelo T1/2. O T1/2 representa o tempo necessário para que o complemento presente no soro lise uma suspensão de eritrócitos padronizada. O valor de T1/2 é inversamente proporcional à AH, isto é, quanto menor o valor de T1/2, maior a AH do SC. Nós observamos um aumento significativo da AH da via clássica (VC) nos Grupos 1 e 2, quando comparados ao controle e uma diminuição significativa da AH no Grupo 3, quando comparada aos Grupos Controle, 1 e 2. Também não há muitos dados na literatura para fundamentar nossos resultados. Booth e Lucchesi (2007) mostraram que o tratamento com estrogênio reduziu a ativação do SC, em um modelo de isquemia cardíaca em coelho, e que esse efeito foi antagonizado por progestagênio. É muito difícil relacionar este resultado com os nossos, por se tratarem de modelos diferentes. No nosso estudos, nos Grupos 1 e 3 há a mesma concentração de estrogênio (30g) e a AH destes é influenciada de maneira inversa, com aumento e diminuição, respectivamente.

A drospirenona é o progestagênio dos Grupos 1 e 2, os quais diferem quanto à concentração de estrogênio, 30g no primeiro e 20g no segundo grupo, e esses grupos não apresentaram diferenças na AH entre si, mas mostraram um aumento significativo em relação ao controle e ao Grupo 3. Contudo, os Grupos 1 e 3 diferem quanto ao tipo de progestagênio, drospirenona e levonorgestrel, respectivamente. Este resultado sugere

um efeito modulador da AH da VC do SC por diferentes progestagênios, a qual merece atenção e precisa ser investigada mais detalhadamente.

Uma vez que os radicais livres, tais como as ERO, estão envolvidos na lesão tecidual associada com os processos inflamatórios, dentre estes a ativação do complemento, no nosso estudo podemos especular que o efeito do CHC do Grupo 1 no aumento da QL dos neutrófilos, somado ao aumento da atividade hemolítica, pode ter implicações nos processos inflamatórios crônicos. Obviamente, a hipótese de um efeito benéfico ou adverso deve ser considerada em um contexto mais amplo e bem definido para cada modelo.

Ainda quanto à influência dos CHC na ativação da VC e nenhum efeito sobre a via alternativa (VA), podemos comentar as inter-relações do sistema complemento com a hemostasia. O SC e a hemostasia têm implicações clínicas importantes no contexto da lesão tecidual e da inflamação. Embora esses sistemas tenham sido descritos como cascatas separadas, ambos pertencem a uma complexa rede inflamatória e exibem algumas características similares e comuns em relação às funções de seus ativadores e inibidores. Em particular, o inibidor de C1 e as proteínas C e S (AMARA et al., 2010).

Várias interações entre o SC e a hemostasia têm sido propostas, embora ainda não completamente elucidadas (AMARA et al., 2008). Atenção especial é dada ao angioedema observado na terapia de reposição hormonal com estrogênio (BINKLEY; DAVIES, 2000; 2004; BORK et al., 2003; 2006). O estrogênio pode precipitar ataques de angioedema, enquanto o progestagênio pode ser protetor (KAPLAN, JOSEPH, 2010).

O fator XII ativado (FXIIa) da coagulação pode ativar o componente C1r do complemento e iniciar a ativação da VC. O inibidor de C1 controla negativamente as 3 vias de ativação do SC e também a via intrínseca da coagulação (a calicreína e o FXIIa) (DAVIES et al., 2008).

No angioedema provocado pelo estrogênio, os pacientes têm níveis funcionais normais de inibidor de C1 e na maioria são mulheres (KAPLAN, JOSEPH, 2010). Há um subgrupo de pacientes com angioedema que apresentam uma mutação no gene do FXII, que quando ativado, tem uma atividade muito maior do que a proteína normal (CHICON et al., 2006), levando ao aumento da produção de bradicinina, que resulta em angioedema.

Além deste mutante, altos níveis de estrogênio, como na gravidez e no uso de contraceptivos orais, estão associados com o aumento do FXII, provavelmente devido a um fator responsivo ao estrogênio na região promotora para o gene do FXII (FARSETTI et al., 1995). Sob condições com elevados níveis de estrogênio, a maior disponibilidade do FXII para a ativação favorece a produção da bradicinina. Os níveis aumentados de estrogênio durante a gravidez e o uso de contraceptivos também podem estar associados com níveis reduzidos do inibidor de C1. O inibidor de C1 inibe o FXIIa e a calicreína; a redução da inibição do FXIIa e da calicreína com altos níveis de estrogênio também favorece a formação da bradicinina. Somado a isso, o estrogênio ainda suprime a expressão da enzima conversora de angiotensina (ECA), que degrada a bradicinina e seu metabólito ativo. O aumento de estrogênio e a diminuição da ECA favorecem o acúmulo da bradicinina. Esta por sua vez é um importante mediador da vasodilatação e extravasamento de líquido, ocasionando o inchaço característico do angioedema (BINKLEY, 2010).

No nosso estudo, a avaliação do inibidor de C1 funcional não mostrou diferença entre os grupos. Curiosamente, na análise semi-quantitativa do inibidor de C1 sérico, houve um aumento significativo da concentração do inibidor de C1 no grupo de CHC considerado em conjunto, sem discriminar o tipo de CHC, em relação controle. Quando consideramos os diferentes grupos, somente o Grupo 3 mostrou níveis do inibidor de C1 significativamente elevados quando comparados ao Grupo Controle. No Grupo 3 o aumento do inibidor de C1 sérico relacionou-se com a diminuição da atividade hemolítica da VC, que pode estar mais lenta por aumento da inibição do C1 nessa via. Além disso, esse grupo apresentou diminuição do fragmento C4d (produto da ativação das vias clássica/lectina). Uma vez que o inibidor de C1 regula C1 e C4 (KAPLAN; JOSEPH, 2010), a diminuição dos níveis de C4d pode ser devida ao maior nível deste inibidor neste grupo. No entanto, não houve relação dos resultados para os Grupos 1 e 2, onde a AH está mais acelerada e os níveis de inibidor de C1 não diferem do controle.

As voluntárias usuárias de CHC incluídas neste estudo não têm diagnóstico de angioedema. Nós especulamos que este aumento do inibidor de C1 possa estar relacionado com possíveis alterações na hemostasia ocasionadas pelo uso de CHC (VLIEG et al., 2009). O nosso estudo faz parte de um projeto mais amplo que avalia também a hemostasia nos grupos de CHC aqui analisados. No entanto, os resultados da

hemostasia não fazem parte do contexto deste trabalho e não são apresentados aqui, porém podem ser discutidos.

Huber-Lang e colaboradores (2006) demonstraram que a trombina é capaz de gerar o produto de ativação C5a na ausência de C3 em estudo murino. Em outro estudo, Clark e colaboradores (2008) sugeriram que a trombina e a plasmina podem contribuir para uma ativação não tradicional do complemento na ausência de C4 e durante a inibição do fator B.

Amara e colaboradores (2010) mostraram que a trombina, o FXIIa e a plasmina são capazes de gerar C3a e C5a in vitro. Além disso, o FXIIa resultou na diminuição da AH do soro. Estes resultados podem suportar nossas observações, em especial para o Grupo 3, que apresentou resultados significativamente diferentes em relação ao controle. No Grupo 3 observou-se aumento do tempo de protrombina (resultado não apresentado) e uma tendência ao aumento do FXII. Como demonstrado por Amara e colaboradores (2010), a trombina pode ativar C3. Portanto, os resultados sugerem que um maior consumo de C3 pode comprometer a amplificação da ativação da VC e assim reduzir a AH do Grupo 3. Este aumento no consumo de tempo de protrombina não ocorre nos Grupos 1 e 2 e, ao contrário do Grupo 3, há uma maior AH ainda não explicada.

A tendência ao aumento do FXII pode sugerir que no Grupo 3, neste momento, há uma maior demanda de inibidor de C1, o que explicaria o aumento do inibidor de C1 sérico, que por sua vez ocasionaria a diminuição da AH da VC e conseqüentemente do C4d sérico. No entanto, é difícil explicar a diminuição do C4d e aumento da AH da VC nos Grupos 1 e 2, com níveis de inibidor de C1 igual ao Grupo Controle. No estudo realizado por Liu et al. (2005) observou-se um aumento da ligação do fragmento C4d nos eritrócitos de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo, sugerindo que esta característica possa ser uma marcador da ativação da VC e atividade da doença. Se o aumento da AH da VC nos Grupos 1 e 2 poderia ser resultante da deposição de C4d nos eritrócitos, reduzindo os níveis séricos deste fragmento, precisa ser investigado. De qualquer forma, se essa hipótese for verdadeira, provavelmente a redução dos níveis séricos de C4d nos Grupos 1 e 2 teriam causas diferentes da mesma redução observada no Grupo 3.

Já a análise da VA não mostrou diferença entre os grupos de CHC e o Grupo Controle. Os resultados para a VA estão de acordo com a literatura que apontam as principais interações moleculares do SC e da coagulação com a regulação mediada pelo

inibidor de C1, envolvendo principalmente a VC do SC (BINKLEY, 2010). Ainda que recentemente a literatura apontou para interações moleculares entre o SC e a hemostasia, demonstrando a participação das serinas proteases, comuns a ambas as vias, na clivagem de C3 e C5, o FXIIa foi a mais eficiente de todas (AMARA et al., 2010). Considerando-se que o FXII é regulado pelo inibidor de C1, a interação com a VC parece ser mais óbvia.

Em conjunto, no cenário do foco inflamatório, pode-se imaginar que vários fatores da coagulação contribuem local e sistemicamente para a geração de C3a e C5a, os quais, por sua vez, são quimioatraentes para os fagócitos. Estas células liberam proteases, ERO e citocinas no local da inflamação. As citocinas pró-inflamatórias podem levar à diminuição de proteínas anticoagulantes, por exemplo, proteínas C e S. As atividades pró-coagulantes do SC são aumentadas quando mecanismos anticoagulantes são inibidos, de modo a estabelecer interações de equilíbrio entre os dois sistemas. Frente a esta rede tão complexa, o SC e a hemostasia devem ser analisados em um contexto unificado (ESMON, 2004; MARKIEWSKI et al., 2007; AMARA et al., 2010). O entendimento deste processo torna-se um desafio ainda maior quando somamos a esta rede o efeito dos diferentes CHC, cada um com sua estrutura molecular, dose e variedade de receptores amplamente distribuídos em diferentes tecidos.

Muitas das observações neste estudo são difíceis de rrelacionar com a literatura, em parte pela escassez de estudos abordando as interações SC, hemostasia e CHC. Mas, sobretudo porque se faz necessário um estudo multicêntrico e multidisciplinar, reunindo as observações dos efeitos biológicos, dados clínicos e laboratoriais, para, então, definir