Høyttaler- og mikrofonposisjon

A fim de obtermos as proteínas recombinantes de cada gene, subclonamos os genes em vetor para expressão em células procarióticas, vetor PET-22b(+), contendo a sequência de DNA para uma cauda sextupla de histidina (pHIS). Inicialmente, após indução bacteriana, as proteínas recombinantes expressas foram extraídas de acordo com suas solubilidades em tampão aquoso. As proteínas insolúveis (HIS-LACK, HIS-LbSTI1 e HIS-LeIF) foram extraídas em tampão contendo uréia 8M, após processo de sonicação e lavagem em detergente. Já a proteína recombinante HIS-TSA mostrou ser parcialmente solúvel quando extraída por sonicação em comparação a extração em ureía 8M (dados não mostrados).

Observamos que o padrão eletroforético de migração destas proteínas recombinantes em gel SDS-PAGE à 12%, sob condições denaturantes na presença do agente redutor 2-ME, apresentou-se como bandas únicas, com exceção da proteína HIS-LeIF, com seus respectivos pesos moleculares estando de acordo com o descrito na literatura (Mougneau et al., 1995; Webb et al., 1997; Webb et

al., 1998; e Skeiky et al., 1998) (Figura 8, em A). Nós obtivemos um peso

molecular aparente de 36 KDa para a proteína HIS-LACK, de 30 KDa para a proteína HIS-TSA, de 54 KDa para a proteína HIS-LeIF, e de 66 KDa para a proteína HIS-LbSTI1. Com relação à banda secundária na proteína recombinante HIS-LeIF, nós creditamos este fato devido a degradação da mesma durante o processo de expressão da proteína in vitro. E ainda, nós observamos uma pequena alteração no padrão de migração da proteína HIS-TSA (30 KDa) quando comparado aquela descrita na literatura (24 KDa), e a este fato atribuímos a formação de dímeros via pontes de dissulfeto, o que já foi descrito ocorrer (Chae

Após a extração das proteínas recombinantes, as mesmas foram purificadas em coluna de afinidade por níquel ou em gel SDS-PAGE como descrito em Materiais e Métodos.

De acordo com o descrito na literatura, onde o epítopo para reconhecimento por linfócitos T CD4+ de camundongos, presente no antígeno LACK, é conhecido (Launois et al., 1997), realizamos então experimentos de clonagem da sequência de DNA deste epítopo em fusão com a sequência da proteína GST. Amplificação da sequência de DNA foi feita, utilizando-se oligonucleotídeos específicos (Tabela 2), e na região 3´ da sequência gênica da GST, foi clonado a sequência do epítopo para linfócitos T CD4+. Análise de restrição enzimática confirmaram a respectiva clonagem, e a expressão da proteína foi induzida em bactérias. Após purificação e análise por eletroforese em gel SDS-PAGE, observamos um padrão de peso molecular de aproximadamente 33 KDa (Figura 8, em B), que quando comparado a proteína GST apenas, mostrou-se como uma banda de maior peso molecular.

Para verificar se os genes por nós clonados codificavam proteínas com características similares àquelas expressas nos diferentes estágios do parasito, anticorpos policlonais foram utilizados em experimentos de imunolocalização, contra cada proteína de interesse. Para tanto, camundongos BALB/c foram imunizados com as respectivas proteínas recombinantes em ACF, e numa segunda dose em AIF, cada qual contendo 10µg de cada proteína recombinante. Os camundongos controles foram imunizados com CFA apenas. O soro dos animais foi obtido como descrito em Material e Métodos.

Por imunofluorescência indireta e através de microscopia “ConFocal” foi possível observar que houve reconhecimento das respectivas proteínas em ambas as formas parasitárias (promastigotas e amastigotas) de L. (V.) braziliensis, utilizando-se o soro dos animais imunizados para cada antígeno.

Para as formas promastigotas, a imunofluorescência mostrou ter tido reconhecimento antiparasitário com padrão em comum a cada antígeno, a partir do soro dos animais imunizados, sendo de forma difusa ao longo do citoplasma parasitário, comparável à imunofluorescência obtida a partir do soro de animais infectados experimentalmente com L. (V.) braziliensis (Figura 9).

Ainda nas formas promastigotas, para o antígeno LACK, a imunofluorescência não apresentou nenhum reconhecimento que pudesse evidenciar uma região de compartimentalização para este antígeno, apesar de pontos mais fluorescentes poderem ser observados às vezes perto do núcleo parasitário, por vezes próximo à membrana. Já para o antígeno TSA, a imunofluorescência pareceu estar concentrada por vezes em áreas ao longo do citoplasma de algumas formas, e com padrão mais difuso quando comparado ao antígeno LACK. Para o antígeno LeIF, observamos uma imunofluorescência dispersa ao longo do citoplasma, de padrão difuso, não evidenciando áreas onde pudesse estar ocorrendo uma compartimentalização da proteína, sendo fraca no reconhecimento flagelar. A imunofluorescência para o antígeno LbSTI1 também

puntual nas regiões anterior e posterior destas formas parasitárias.

O controle negativo foi feito utilizando soro de animais imunizados com CFA apenas, e o mesmo mostrou uma imunofluorescência muito fraca ao longo de todo o citoplasma. Já o controle positivo, sendo soro de animais infectados com L.

(V.) braziliensis, mostrou uma imunofluorescência forte ao longo de todo o

Para as formas amastigotas (Figura 10) obtidas a partir de infecção in vitro de macrófagos peritoneais, a imunofluorescência para o antígeno LACK mostrou ter sido às vezes de forma difusa e por vezes puntual ao longo do citoplasma e núcleo da célula hospedeira, assim como no citoplasma parasitário, apesar de apresentar por vezes estruturas lineares no citoplasma das formas amastigotas. Para o antígeno TSA, a imunofluorescência mostrou estar focada somente nas formas parasitárias, com padrão puntuado no citoplasma do mesmo, e com marcação na superfície de algumas formas amastigotas. Para os antígenos LeIF e LbSTI1, as imunofluorescências mostraram-se similares a do antígeno LACK, com marcação puntuada granular no citoplasma, às vezes localizada na superfície parasitária.

Em parte, o padrão de reconhecimento utilizando-se soro dos animais imunizados foi semelhante aquele utilizando o soro de pacientes infectados por L.

(V.) braziliensis, como pode ser observado através da sobreposição das duas

imagens obtidas para cada antígeno (Figura 10, imagens fundidas).

O controle negativo utilizado no experimento foi soro de animais imunizados com CFA apenas, mostrando não haver reconhecimento dos macrófagos infectados. Na mesma coluna, quanto ao soro de pacientes infectados com L. (V.) braziliensis, este foi utilizado como um controle positivo do reconhecimento antiparasitário. A reação para macrófagos não infectados foi negativa (dados não mostrados).

4.3. Resposta imune induzida pela imunização utilizando-se antígenos de L.