Actors involved in establishing the Kilosa REDD+ pilot project

As sequências das tags 3 cópias por biblioteca foram utilizadas para encontrar as sequências de cDNA de origem no banco de dados de ESTs do projeto genolyptus e/ou no banco de dados públicos do NCBI. O projeto genolyptus foi lançado em 2002 como uma parceria de 12 empresas do setor de papel e celulose, 7 Universidades, a Embrapa e o Ministério da Ciência e Tecnologia. O genolyptus foi formado a partir do sequenciamento de 70893 ESTs que resultaram na construção de 23292 contigs representativos de amostras de folhas, plântulas, raízes, xilema, floema e flores das espécies de eucalipto: E. globulus, E. grandis, E. pellita e E. urophila.

O contraste das sequências das tags e as sequências de ESTs foi realizado usando a ferramenta de bioinformática BLAST-N que compara sequências de nucleotídeos com uma base de dados também formada por sequências de nucleotídeos (ALTSCHUL et al., 1997). O resultado do BLAST-N fornece uma lista das sequências de ESTs onde é possível encontrar toda a sequência usada no BLAST-N, ou seja, os 4 pb do sítio de reconhecimento da enzima Nla III (CATG) seguidos pelos 10 pb da tag. No entanto, não fornece informações importantes como a presença de outros sítios CATG após a tag e se há ou não uma cauda poli(A) 3’ indicando término da sequência. Assim, todas as sequências de ESTs buscadas foram analisadas manualmente e somente aquelas que obedeceram aos critérios acima mencionados foram utilizadas na anotação das tags (Figura 15).

Figura 15 - Sequência ilustrativa de um EST utilizado na anotação de uma tag. Em negrito estão todos os possíveis sítios de restrição da enzima Nla III, em negrito e sublinhada está a sequência da tag específica utilizada no blast(n) e na extremidade 3’ da sequência é possível observar a presença de um terminal poli(A)

Além disso, a biblioteca de madeira foi anotada quase que exclusivamente a partir de ESTs de amostras de xilema e floema enquanto a biblioteca de folhas foi anotada apenas preferencialmente a partir de ESTs de folhas devido a pequena representatividade de ESTs de folhas depositados no genolyptus e ausência nos bancos de dados públicos. Todo o procedimento de anotação das tags foi realizado como dois eventos separados, primeiramente na anotação das tags da biblioteca de madeira e depois na anotação das tags da biblioteca de folhas, garantindo assim que os resultados fossem também utilizados na análise do potencial de uso de sequências curtas de 10 pb como “etiquetas” para a associação única e correta entre a tag e o gene.

As sequências de ESTs representativas de cada tag foram então usadas no programa BLAST-X (ALTSCHUL et al., 1997) tendo como banco de referência o NCBI. O BLAST-X é usado para comparar sequências de nucleotídeos traduzidas em todos os três quadros possíveis de leitura contra sequências de proteínas. O resultado do BLAST-X é uma lista de alinhamentos possíveis ordenados de acordo com a confiabilidade do alinhamento a qual é medida pelos valores de E. Estes valores indicam a probabilidade de um dado alinhamento de pontuação igual ou maior ocorrer ao acaso numa dada base de dados, ou seja, quanto maior o valor de E maior a probabilidade do alinhamento ser um produto do acaso (ALTSCHUL et al., 1997). Neste trabalho, apenas alinhamentos com valores de E e-07 foram utilizados na anotação das tags.

Para a realização de uma análise funcional e mais dinâmica dos genes expressos em cada uma das bibliotecas foi realizada também uma classificação funcional dos genes anotados em categorias seguindo a classificação originalmente proposta por RISON et al. (2000) (Tabela 3)

>Contig940gr-ml (whole contig)

5’CTCCTCTTTTTGAGTTGTCAGGAGAGGAGCTGCAGAAGGGAAAATGGCTGCCGCAACGGCATCTC CCATGGCCAGTCAGCTCAAGAGCAGCTTTGCATCATCATCATCCAGGAGCCTGATTGCTCCCAAGG GCCTCTCTGGTTCCTCCTTCAGAGCCTCGCCCACCAGGAGGACTCGCTCCTTCACTGTCAAGGCTAT CCAATCCGAGAAGCCAACCTTCCAAGTGGTTCAACCCCTCAATGGTGACCCTTTCATTGGAAGCCT CGAGACTCCGGTCACATCCAGCCCTCTCATTGCATGGTACCTCTCCAACCTCCCCGCCTACAGGAC TGCCGTGAACCCGCTCCTCCGAGGCGTCGAGGTGGGCCTCGCCCACGGATTCCTCTTGGTGGGCCC CTTCGTCAAGGCCGGCCCTTTGAGGAACACGGAGTATGCAGGAGCAGCAGGATCATTGGCCGCCG GAGGCCTGGTTGCGATCCTGAGCATCTGCTTGACAATGTATGGGATCGCCTCATTCAATGAAGGAG AGCCCTCGACAGCACCGTCGCTAACCTTGACCGGGAGGAAGAAGGAGCCTGATCAGTTGCAGACC GCAAATGGATGGGCCAAGTTCACCGGCGGGTTCTTCTTCGGCGGGATCTCTGGGGTCACATGGGCC TACTTTCTCCTCTATGTGCTCAACCTTCCTTACTTTGTGAAGTAAATTCATACAGAAGAGAGAGATG AAGTTGAAGAGTCATGTCTGTATATCTGAACCGTTTGGGAAGGAATGGGATTGAGGAAATTTCAT GTCATTTAGCTCTGTATAAGCCGGAATTTCCCTGGACTTTGTCAAAGAATGTGCATTCGTAGAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA GG 3’

com pequenas modificações como a inclusão da subcategoria transporte de vesículas e fatores transportadores na categoria transporte, e a inclusão da subcategoria citoesqueleto na categoria estrutura e organização da estrutura celular. Além disso, os ESTs que representaram tags anotadas com a mesma função foram utilizados em análises de alinhamento (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi) para verificar a ocorrência de isoformas gênicas ou genes distintos.

Tabela 3 - Classificação Funcional de RISON et al. (2000). Os números representam as funções-chave ou principais

1 Metabolismo 4 Estrutura e organização da estrutura celular

1.1 Energia 4.1 Envoltórios celulares/Membranas

1.1.1 Metabolismo autotrófico 4.1.1 Membrana celular 1.1.2 Metabolismo de carbono 4.1.2 Parede celular 1.1.3 Transferência de energia/ATP 4.2 Matrix extracelular

1.2 Macromoléculas 4.2.1 Estruturas de superfície

1.2.1 Polissacarídeos/Lipossacarídeos 4.3 Ribossomos

1.2.2 Proteoglicanas/Glicoproteínas 4.3.1 RNAs ribossomais 1.2.3 Lipídeos/Lipoproteínas 4.3.2 Proteínas ribossomais

1.3 Pequenas moléculas 4.4 Citoesqueleto

1.3.1 Metabolismo de aminoácidos 4.4.1 Relacionados ao cromossomo 1.3.2 Metabolismo de Nitrogênio 4.4.2 Relacionados às organelas 1.3.3 Metabolismo de nucleotídeos

1.3.4 Metabolismo de fósforo 5 Vias de Informação

1.3.5 Metabolismo de carboidratos 5.1 Relacionada ao DNA 1.3.6 Metabolismo de Lipídeos 5.1.1 Síntese e Replicação

1.3.7 Vitaminas/co-fatores/grupos prostéticos 5.1.2 Restrição/modificação/reparo 1.3.8 Metabolismo Secundário 5.1.3 Recombinação

5.1.4 Degradação

2 Processos 5.2 Relacionada ao RNA

2.1 Processos celulares 5.2.1 Síntese

2.1.1 Divisão celular 5.2.2 Transcrição

2.1.2 Tradução de sinais 5.2.3 Modificação

2.1.3 Direcionamento de proteínas 5.2.4 Degradação

2.1.4 Regulação celular 5.3 Relacionada a proteínas

2.2 Processos do organismo 5.3.1 Síntese de proteínas

2.2.1 Adaptação 5.3.2 RNAt

2.2.2 Respostas de proteção/detoxificação 5.3.3 Relacionada à tradução 2.2.3 Respostas a estímulos 5.3.4 Modificação/fosforilação

5.3.5 Modificação/estrutura quaternária

3 Transporte 5.3.6 degradação

3.1 Grandes moléculas

3.1.1 proteínas 6 Outros

3.1.2 Ácidos nucléicos 6.1 Não classificado (sequência expressa)

3.2 Pequenas moléculas 6.2 Não classificado (proteína de função hipotética) 3.2.1 Canais de íons/porinas 6.3 Sem função conhecida (sem homologia) 3.2.2 Transportadores de açúcares e carboidratos

3.2.3 Transportadores de aminoácidos

3.2.4 Transportadores de nucleotídeos/nucleosídeos 3.2.5 Fatores Transportadores

Por fim, os dados gerados no sequenciamento e análise das bibliotecas SAGE foram armazenados como “fichas eletrônicas” para tags dentro de grupos em um banco de dados para análise de genômica funcional de E. grandis, construído localmente com o auxílio de Lívia Maria Franceschini (bio-informata do laboratório de Max Feffer de genética fisiológica) (Figura 16).

Figura 16 - Fichas “eletrônicas” do banco de dados local de genômica funcional de E. grandis. (a) Ficha da tag com informações cadastradas para a biblioteca de madeira. (b) Ficha da tag com informações cadastradas para a biblioteca de folhas. Para a mesma tag foram criadas duas fichas diferentes buscando a melhor associação tag/gene para cada um dos tecidos avaliados. Observe que a ficha do banco de madeira foi construída a partir de um EST com a mesma origem (gl-xy: xilema de E. globulus) enquanto a ficha do banco de folhas foi construída a partir de um EST sequenciado a partir de folhas maduras de E. grandis (gr-ml)

EST de folhas de E. grandis EST de xilema de E. globulus

Biblioteca de folhas Biblioteca de madeira

a)

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO