Chapter 3: The IT policy discussion in Europe
VI. Theme Papers
3.4. Globalisation: Global Information Networks
Os resultados de atividade de todas as enzimas analisadas foram expressos como porcentagem (%) da atividade residual média, a qual é calculada a partir da razão entre o valor médio de atividade específica (A) encontrado no suco para um determinado tempo de tratamento e a atividade média específica inicial (A0) que representa a atividade no suco não tratado, multiplicado por 100.
4.6.2 Cálculo de parâmetros cinéticos
Além da atividade residual, também foram calculados alguns parâmetros cinéticos da atividade enzimática. Segundo Terefe et al. (2009), para alimentos processados, reações enzimáticas de primeira ordem são comumente expressas pelos valores de k e D, onde k representa a constante de inativação enzimática de primeira ordem (expressa em min-1) e D é o tempo (min) necessário para que uma enzima perca 90% de sua atividade. Esses parâmetros podem ser estimados partir do gráfico do log (A/A0) sob determinada temperatura versus tempo de exposição, onde o k corresponde à tangente desse gráfico e o D é a razão entre 2,303
e k (D = 2,303 / k). Dessa forma, a inativação enzimática à medida que a temperatura do meio se eleva é acompanhada por um aumento no valor de sua constante de inativação e uma redução no valor D.
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os tratamentos térmicos são utilizados para manter a estabilidade de produtos alimentícios a fim de remover microorganismos e inativar enzimas, tais como as peroxidases e as pectinases que poderiam deteriorar o produto final, reduzindo assim seu tempo de vida útil (CORREIA et al., 2008). O tratamento térmico mostra-se eficiente na inativação de enzimas pelo fato do calor promover a desnaturação de proteínas por modificação de sua estrutura conformacional, evitando que o substrato chegue até o sítio ativo de sua respectiva enzima (MARTÍNEZ et al., 2006). Porém, esse tipo de processamento também pode acarretar perdas nutricionais e levar à inativação de compostos que, quando presentes, aumentam os índices de qualidade e aceitação desses produtos, como é o caso dos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos que atuam na eliminação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais depreciam a qualidade e o tempo de prateleira de alimentos de origem vegetal. Todavia, não há relatos na literatura sobre os efeitos do tratamento térmico na atividade de enzimas antioxidantes.
A Tabela 1 mostra os valores de atividade específica das enzimas analisadas nos sucos que não foram submetidos a tratamento térmico (suco controle ou tempo zero), a qual serviu de referência para o cálculo da atividade residual.
Tabela 1. Atividade específica de enzimas do suco de caju e graviola não tratados termicamente
Enzima Suco Atividade Específica
SOD
(UA.mg proteína-1)
Caju 7,14 ± 0,03
Graviola 10,72 ± 0,04
APX
(µmol H2O2.min-1.mg proteína)
Caju 0,60 ± 0,00
G-POD
(µmol H2O2.min-1.mg proteína)
Graviola 0,02 ± 0,00 PPO (UAE.min-1.mg proteína) Caju Grviola - - CAT
(µmol H2O2.min-1.mg proteína)
Caju 74,00 ± 0,06
Graviola -
PME
(UAE. min-1.mg proteína)
Caju 501,84 ± 32,1
Graviola 7128,15 ± 45,3
PG
(mol AR.min-1.mg protein)
Caju 50,42 ± 3,02
Graviola 42,85 ± 2,07
5.1 Enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento
5.1.1 Dismutase do superóxido
Dismutase do superóxido são metaloenzimas que apresentam um papel chave na proteção contra o estresse oxidativo (MORAN et al., 2003; SANTOS et al., 2000). As Figuras 1(A e B) mostram os resultados de atividade da dismutase do superóxido nos sucos de caju e graviola submetidos a tratamento térmico, respectivamente. No suco de caju, a SOD mostrou uma resistência ao tratamento térmico, de modo que em 55 °C a atividade dessa enzima pouco foi alterada, mantendo-se sempre com mais de 80% de sua atividade residual até o fim do tratamento. A exposição a 65 °C provocou uma redução na atividade dessa enzima após 5 min de tratamento, que se manteve por todo o experimento chegando a 45% de redução na atividade residual ao final dos 30 min de exposição. Aos 75 °C há uma queda quase linear na atividade da SOD nos 15 min iniciais de tratamento chegando a atividade residual a 61,5%. O tratamento a 85 °C provoca as maiores perdas na atividade dessa enzima logo no início do tratamento com perda de 63% após 1 min e após essa queda inicial, o aumento no tempo de exposição a essa temperatura provoca uma relativa manutenção na atividade residual da SOD, mostrando que a enzima do suco de caju apresenta uma elevada resistência a altas temperaturas. Para corroborar com essa afirmação, a exposição desse suco a 95 °C resultou em um decréscimo no primeiro minuto e depois, em uma recuperação e manutenção da atividade até os 30 min, quando atingiu 74%.
Quando o suco de graviola foi submetido a uma temperatura de 55 °C, a atividade da SOD decaiu no primeiro minuto seguido por um pico atingido 150% de atividade residual aos 5 min, depois do qual decaiu para 67%. Aos 65 °C houve uma redução na atividade da SOD seguida de aumento aos 10 min para depois decair continuamente até atingir 6,7%, aos 30 min. Já aos 75 °C, a SOD do suco de graviola apresentou apenas 11% de sua atividade inicial aos 5 min e foi completamente inativada após 10 min. Quando o suco foi exposto a 85 e 95 °C, a enzima em questão só resistiu ao primeiro minuto de tratamento, sendo totalmente inativada após 3 min.
Figura 1. Atividade residual da SOD nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes temperaturas.
A Tabela 2 mostra os valores de alguns parâmetros cinéticos calculados para a atividade da SOD após o tratamento térmico. A constante de inativação k reflete a propriedade de inativação das enzimas de modo que, quanto maior for o seu valor, maior será a inativação. Os valores de k foram muito baixos para a enzima proveniente do suco de caju em todos os tratamentos, refletindo sua elevada estabilidade térmica. A SOD do suco de graviola não foi inativada pelo tratamento a 55 °C (Figura 1B), mas os elevados valores de k em temperaturas a partir de 65 °C mostram sua sensibilidade a esses tratamentos.
Tabela 2. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da SOD em suco de de caju e graviola.
Temperatura (°C) Suco k (min-1) D (min)
55 Caju 0,003 767,66 Graviola 0,003 767,66 65 Caju 0,044 52,34 Graviola 0,118 19,51 75 Caju 0,023 100,13 Graviola 0,359 6,41 85 Caju 0,009 255,88 Graviola 0,287 8,02 95 Caju 0,006 383,83 Graviola 0,262 8,79
Já o parâmetro D está relacionado com o tempo necessário para reduzir em 90% a atividade enzimática inicial de modo que, quanto maior for o seu valor, mais lentamente a enzima está sendo inativada. O valor D (767,66) do suco de caju tratado a 55 °C pode ser associado ao baixo valor k indicando que dificilmente será inativada nessas condições. Aos 95 °C, os valores de D mostram que a SOD do suco de caju demoraria 383,8 min, enquanto a de graviola demoraria 8,7 min para reduzir em 90% sua atividade. Então, como pôde ser visto a SOD proveniente do suco de caju mostrou-se muito mais resistente ao tratamento térmico do que a do suco de graviola e essa diferença pode ser devido às diferenças próprias de cada espécie vegetal e à forma de preparo de cada suco, prensagem e homogeneização, respectivamente. O suco de caju apresentou uma maior quantidade de partículas em suspensão, o que pode ter contribuído para uma maior estabilidade térmica de suas enzimas, uma vez que estas são protegidas pela presença de outras biomoléculas, tais como proteínas, carboidratos e pectinas (WHITAKER, 1972).
Scalzo et al. (2004) analisando os efeitos do processamento térmico sobre os antioxidantes presentes em suco de Citrus sinensis (L.) observaram que um tratamento a 80
°C por 6 min é capaz de reduzir significativamente os conteúdos de antioxidantes não enzimáticos como o ácido ascórbico e antocianinas, além de promover uma redução na capacidade antioxidante total. Na literatura não há relatos sobre temperatura ótima, estabilidade térmica e comportamento cinético da SOD para que sejam comparados aos dados encontrados nesse trabalho.
5.1.2 Peroxidases
A peroxidase (POD) é do grupo das oxidoredutases, sendo capaz de catalisar um grande número de reações oxidativas que resultam em alterações de sabor e coloração de frutos e seus derivados (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981). Para evitar essas reações indesejáveis, tratamentos térmicos capazes de inativar essas enzimas são usualmente empregados para a preservação desses produtos alimentícios (WILLIAMS et al.,1986). As peroxidases são geralmente consideradas as enzimas mais termoestáveis em plantas (KHAN et al., 1993). Como consequência dessa termoestabilidade, elas têm sido amplamente usadas como um indicador de tratamentos térmicos em alimentos processados (KHAN et al., 1993; CLEMENTE, 2002).
A APX é a peroxidase mais importante na degradação do H2O2, catalisando a redução dessa espécie reativa à água usando o poder redutor do ascorbato (NOCTOR E FOYER, 1998). A G-POD é uma isoforma de peroxidases que utiliza um composto fenólico como agente redutor, o guaiacol (o-metoxifenol), para promover a degradação do H2O2. A oxidação de compostos fenólicos resulta na formação de compostos de coloração escura (TAYEFI- NASRABADI et al., 2011). Os sucos de caju e graviola foram avaliados quanto à atividade das duas formas de peroxidases, porém a única encontrada no suco de caju foi a APX e no suco de graviola, foi a G-POD. Então, a Figura 2 (A e B) mostra a atividade residual da peroxidase do ascorbato no suco de caju e da peroxidase do guaiacol no de graviola.
Figura 2. Atividade residual da APX no suco de caju (A) e G-POD no suco de graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes temperaturas.
No suco de caju, a atividade residual da peroxidase do ascorbato sofreu um declínio em sua atividade residual logo no primeiro minuto de todos os tratamentos aplicados e depois voltou a aumentar principalmente a 55 °C atingindo menos de 80% ao final dos 30 min. As demais temperaturas testadas tenderam a reduzir atividade por até 20 min, então quando se pôde observar um novo aumento. Esses resultados indicam que a temperatura mais baixa utilizada estimulou a APX e que as demais temperaturas inicialmente a reduziram, porém ao final, isoformas mais resistentes foram ativadas.
No suco de graviola, o tratamento a 55 °C promoveu uma redução lenta na atividade residual da G-POD, a qual manteve apenas 54,1% de sua atividade residual após 30 min. As temperaturas igual e acima de 65 °C provocaram uma drástica queda na atividade logo no primeiro minuto de tratamento levando à inativação dessa enzima, apesar desta ser considerada pela literatura como uma enzima termoresistente.
A atividade da G-POD não foi detectada em suco de caju, o que sugere que possíveis alterações na coloração devido a reações que provocam escurecimento não se devem à ação dessa enzima. Damasceno et al. (2008) concluíram que o escurecimento observado em suco de caju durante seu armazenamento pós-tratamento térmico era devido à degradação da vitamina C e não à ação enzimática.
Um outro estudo mostrou que diferentes temperaturas de pasteurização reduziram a atividade de peroxidases na polpa de graviola (TEIXEIRA et al., 2006). Após um segundo a 70 °C, a atividade residual dessa enzima caiu para 57,4% chegando até 27,4%, após 5 min. Nesse mesmo trabalho, a aplicação de temperaturas mais elevadas não resultou em menores atividades e, apesar da pasteurização acima de 80 °C não ter inativado a peroxidase na polpa de graviola, os autores consideraram o tratamento aplicado como bastante eficiente na conservação desses produtos. Esses resultados mostram que a peroxidase na polpa de graviola mostrou-se muito mais resistente a elevadas temperaturas do que as formas presentes no suco aqui analisado. Essa diferença de resultados pode ser devido ao processamento que desintegra a estrutura dos tecidos e/ou à ação de diferentes isoformas de peroxidases que podem apresentar diferentes estabilidades térmicas. Há uma grande variedade de isoformas dessa enzima em plantas superiores, onde mais de 40 genes são codificadores de isoperoxidases e várias outras isoformas podem ser geradas por modificações pós-transcricionais e pós- traducionais (DE MARCO et al., 1995; WELINDER et al., 1996).
Freitas et al. (2008) relataram que o tratamento térmico de sucos de uvas das variedades „Benitaka‟ e „Rubi‟ resultou em decréscimo na atividade da POD, porém o
comportamento de inativação foi não linear. Assim, a maior inativação enzimática foi obtida na temperatura de 85 °C e com tempo de exposição de 10 min. No entanto, observou-se que os tratamentos térmicos utilizados não foram suficientes para a total inativação dessa enzima. Valderrama et al. (2001) observaram um comportamento similar a esse quando estudaram essa enzima em maçãs. A peroxidase de suco de cenoura apresentou uma alta termoestabilidade mantendo-se ativa mesmo após 150 min de exposição a 70 °C (JAKOB et al., 2010)
A atividade de peroxidases de extratos de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis) submetidos a tratamento térmico manteve-se em 100% mesmo após uma exposição por 30 min a 50 °C (RAYAN et al., 2011). Quando a temperatura aumenta para 85°C, a atividade cai para 11,6% restando apenas 2,1%, a 100 °C. Um trabalho com suco de laranja mostrou que a peroxidase era quase completamente inativada em temperaturas acima de 62 °C (HIRSCH et al., 2008). Esses resultados se assemelham aos apresentados aqui com o suco de graviola. Anthon et al. (2002) também observaram que a peroxidase de suco de tomate CXD 199 foi rapidamente inativada a 72 °C, apresentando uma menor estabilidade térmica do que PME e PG desse mesmo suco.
Publicações anteriores descreveram uma forte influência do pH do extrato enzimático, além da temperatura, sobre a estabilidade térmica das peroxidases (MCLELLAN et al., 1995; CLEMENTE et al., 1995; CLEMENTE, 2002). De modo que há uma inativação total das POD quando em pH 3,5 e expostas a temperaturas acima de 76 °C por 30 s. Abbo et al. (2006) observaram um aumento na acidez de sucos de graviola após um processo de pasteurização. Isso pode explicar a baixa resistência térmica da G-POD encontrada aqui no suco de graviola que resultaria do fato de o tratamento térmico promover uma redução no pH do meio propiciando uma desestabilização de tais enzimas.
A Tabela 3 mostra os resultados encontrados para os parâmetros cinéticos avaliados da APX do suco de caju e da G-POD do suco de graviola. Apesar da queda inicial na atividade residual (Figura 2A) e de acordo com o valor de k inexistente, não houve inativação da APX no suco de caju tratado a 55 °C. Os demais tratamentos também não chegaram a inativar essa enzima durante o período de tempo utilizado nesse experimento, o que seria bom para a preservação do suco de caju (NOCTOR E FOYER, 1998). Para o suco de graviola, os valores de k aumentam com as temperaturas testadas e de modo que, a 95 oC, o valor de D indica que a atividade inicial da G-POD é reduzida em 90% após 9,75 min, nessas condições.
Tabela 3. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da APX do suco de caju e da G-POD do suco de graviola.
Temperatura (°C) Suco k (min-1) D (min)
55 Caju - - Graviola 0,028 82,50 65 Caju 0,014 164,50 Graviola 0,190 12,12 75 Caju 0,021 109,66 Graviola 0,168 13,70 85 Caju 0,073 31,54 Graviola 0,224 10,28 95 Caju 0,037 62,24 Graviola 0,236 9,75
Os elevados valores de constante de inativação refletem a baixa estabilidade térmica da G-POD no suco de graviola. Uma rápida inativação dessa enzima também foi observada por Anthon et al. (2002) ao analisarem POD de suco de tomate das cultivares CXD 199 e BOS 3155 tratados a 70 °C, onde encontraram valores para k de 0,026 e 0,032 s-1 e para D de 1,5 e 1,2 min, respectivamente. Segundo esses autores, os resultados observados foram surpreendentes, uma vez que a POD é uma das enzimas mais termoestáveis encontradas em frutas e legumes.
Os efeitos do tratamento térmico a 66 °C também já foram analisados sobre PODs provenientes de suco de brócolis, cenoura e batata. Foi observado que há duas isoformas dessa enzima em brócolis, as quais diferem quanto a sua constante de inativação (k 0,264 e 0,015 min -1). Já o suco de cenoura apresentou quatro isoformas de POD, para as quais o k sobre essa temperatura foi 3,48; 3,78; 0,0051 e 0,254 min -1. No suco de batata também foram observadas quatro isoformas dessa enzima com valores de k de 42,52; 12,68; 0,0064 e 8,29 min -1. O conhecimento desse parâmetro cinético, o qual reflete a diferença na estabilidade térmica dessas isoformas, pode ser útil na escolha de um tratamento térmico mais eficiente no sentido de inativar completamente a POD (POLATA et al., 2009).
5.1.3 Polifenoloxidase
Não foi detectada atividade da polifenoloxidase nos sucos analisados neste trabalho, o que pode ser devido à ausência dessa enzima em caju e graviola, à desnaturação decorrente do preparo dos sucos ou ao método de análise empregado. De acordo com Murasaki (2005) a
determinação precisa da PPO é um desafio, o que pode ser constatado nos numerosos métodos descritos na literatura. Isto devido as quinonas formadas durante o curso da reação enzimática, proveniente de reações secundárias, substratos não reagentes, oxigênio e outros constituintes da enzima. Estas reações levam à formação de moléculas poliméricas complexas interferindo na análise. A existência de outras enzimas com propriedades similares, tais como peroxidases, podem causar erro na medida da atividade da PPO.
A PPO pode funcionar como um mecanismo de defesa que é ativado quando vegetais e seus derivados são submetidos a condições de estresse. Em um trabalho com suco de caju, Queiroz et al. (2011) observaram que houve um aumento de cinco vezes na atividade da PPO após um período de 24 h a 27 °C e um aumento de apenas duas vezes após 24 h a 40 ° C, mostrando um efeito negativo da temperatura sobre a atividade dessa enzima. Já Zhao et al. (2005) relataram um aumento na atividade de enzimas relacionadas a condições de estresse, inclusive da PPO, em mudas de pepino (Cucumis sativus L.) após estresses simultâneos. Aquino-Bolaños e Mercado-Silva (2004) observaram uma ativação da PPO em extratos de (Pachyrizus erosus L. Urban) após danos mecânicos e armazenamento a 20 °C.
A estabilidade térmica e as propriedades térmicas da PPO têm sido citadas em diversos trabalhos. O problema é que, em alguns são realizadas análises em condições experimentais diferentes, para estudar características das enzimas, em outros, o estudo é sobre diferentes procedimentos de extração e purificação e, portanto torna-se difícil uma comparação direta entre os resultados obtidos (WEEMAES et al., 1998).
5.1.4 Catalase
A catalase é uma enzima que converte o H2O2 em H2O e O2 e é considerada umas das enzimas antioxidantes mais ativas em produtos vegetais (BREUSEGEM et al., 2001). O suco de graviola preparado nesse trabalho não apresentou atividade significativa dessa enzima, portanto a Figura 3 mostra a atividade residual da CAT somente no suco de caju submetido a diferentes temperaturas.
Houve uma grande variação na atividade residual da CAT no decorrer dos tratamentos aplicados, ficando mais fácil explicar o comportamento dessa enzima através de seus parâmetros cinéticos (Tabela 4). Os baixos valores de k observados indicam uma elevada estabilidade térmica dessa enzima, apesar de quedas em sua atividade residual (Figura 3) e como pode ser observado pelos valores de D que, aos 55 °C é 329 min e a 95 °C, cai para 95,9 min.
Figura 3. Atividade residual da CAT em suco de caju sob diferentes temperaturas, em relação ao tempo.
Os resultados sugerem que nesse suco há mais de uma isoforma de CAT com diferentes resistências às temperaturas aplicadas, o que explicaria a variabilidade observada na atividade residual. De acordo com Scandalios et al. (1997), catalases são homoproteínas tetraméricas que existem como múltiplas isoenzimas codificadas por genes nucleares. Não há relatos de estudos relacionados à atividade e/ou ao comportamento cinético da CAT sob tratamento térmico para que sejam comparados aos obtidos nesse trabalho.
Tabela 4. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da catalase em suco de caju.
Temperatura (°C) k (min-1) D (min)
55 0,007 329,00
65 0,008 287,87
75 0,028 82,25
85 0,019 121,21