Os perfis genéticos das comunidades microbianas presentes nos reatores foram avaliados pela técnica da Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante – DGGE (MUYZER et al., 1993). Utilizou-se olígos iniciadores específicos para os grupos de bactérias totais. Na Tabela 4.7, estão representadas as seqüências dos primers para os grupos indicados.
4.3.5.1. Extração do DNA total
Para a extração do DNA total, a amostra foi coletada, centrifugada e lavada três vezes em tampão fosfato (KH2PO4 0,2M, Na2PO4 0,2M, pH 7,00). O
precipitado, em torno de 200 mg de lodo biológico, foi ressuspenso em 2 ml de solução de lise (150 mM de NaCl, 100 mM de EDTA, 5 mg de lisozima.ml-1) e incubado à 37ºC, durante 2 h. Em seguida, 5,0 mg de protease K.ml-1 (Sigma P5147) foram adicionados à solução e esta, incubada à 50ºC, por 15 minutos. Em seguida, adicionou-se, à mistura, 2 ml da solução de SDS (100 mM de NaCl, 500 mM de Tris HCl, 10% de SDS), incubando a mistura por 5 minutos, em temperatura ambiente. Após esta etapa, a solução foi congelada em nitrogênio líquido e descongelada à 65ºC, em três ciclos.
Para a separação do DNA, misturou-se a amostra utilizando-se vortex por 3 a 5 minutos, adicionando-se, em seguida, 500 µL de fenol- clorofórmio, e 500 µL de clorofórmio: álcool iso-amílico (24:1, v/v). A amostra foi novamente agitada no vortex e centrifugada à 7000 rpm, por 30 minutos. Recuperou-se a sua fase aquosa e adicionou-se a ela 30 ml de acetato de sódio 3 M pH 5,0-6,0 (usando, alternativamente, acetato de amônio). Precipitou-se o DNA adicionando-se 2,5
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volumes de etanol absoluto (overnight). Em seguida, centrifugou-se a amostra à 3000 rpm, por 10 minutos. Lavou-se o DNA com 300 ml de etanol 70%, invertendo-se o tubo várias vezes. Centrifugou-se a amostra rapidamente, descartando-se dela o sobrenadante e secando-a à temperatura de 37ºC. Ressuspendeu-se o precipitado em 100 ml, em água milli-Q esterilizada. O DNA foi, posteriormente, purificado utilizando-se o Kit Wizard DNA Clean-Up System (Promega), segundo as instruções de uso do fabricante.
4.3.5.2. Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
Para amplificar a região do gene rDNA 16S, foram utilizados os iniciadores universais F984GC/ R1378 (Tabela 4.6). De modo a proceder à amplificação, em cada tubo de reação foram adicionados: 5 ml do tampão da enzima 5 X, 200 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfatado ; 0.2 mM do primer F984GC; 0,2 mM primer R13780; 1,0 μL de BSA – albumina sérica bovina, 0,5μl de formamida deionizada - ; 10 ng de DNA de cada amostra; 2,5 U de GoTaq DNA polimerase® (Promega), água Milli-Q esterilizada, para um volume final de 25 ml de reação.
A PCR foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient, Eppendorf – Germany), nas seguintes condições: inicialmente, a amplificação foi realizada utilizando-se um touchdown PCR (DON et al., 1991;VAN ELSAS e WOLTERS, 1995) para a redução de amplificações inespecíficas. Durante essa etapa, a temperatura de anelamento foi de 10ºC acima da temperatura de anelamento esperada (65ºC), caindo de 2 em 2ºC até à temperatura de 55ºC, gerando 11 ciclos iniciais. Após essa etapa, 25 ciclos foram repetidos, com a temperatura de anelamento de 55ºC. A etapa de desnaturação inicial das fitas de DNA foi de 5 minutos à 94 ºC e, após a etapa de anelamento, seguiu-se a etapa de extensão de 2 minutos à 72ºC, para todos os ciclos, sendo o último ciclo com extensão final de 10 minutos, à 72ºC.
Tabela 4.6. Seqüências de iniciadores universais usados para a amplificação de PCR fragmentos de 16rDNA.
Primers Seqüência 5’ 3’ (16S rDNA Targed) Referência
F984GC AACGCGAAGAACCTTAC (Bacteria totais) HEUER & SMALLA, 1997
R1378 CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG (Bacteria totais)
HEUER & SMALLA , 1997
GC-Clamp CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGG, 5’ Ligado a F984GC
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4.3.5.3. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)
A eletroforese foi realizada utilizando-se o equipamento DCodeä Universal Mutation Detection System (BIO-Rad – Califórnia USA). Os produtos de PCR foram aplicados em volume de 20 µL, diretamente no gel de poliacrilamida (acrilamida:bisacrilamida37,5:1) a 0,8 % (p/v), em tampão trisacetato-EDTA – TAE 1X (Tris base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; Na2.EDTA.2H2O 10 mmol L-1,
pH 8,0), preparado com gradiente desnaturante variando de 40 a 58%. O gradiente foi formado a partir da mistura de duas soluções-estoque de poliacrilamida, uma com 100% dos agentes desnaturantes, formamida deionizada 40% e uréia 7 mol.L-1, e outra, sem esses agentes desnaturantes, pelo formador de gradiente (Modelo 475 Gradient Delivery System – BIO-Rad Califórnia, USA). Além das soluções-estoque para a formação do gradiente, foram utilizados 125 µL de persulfato de amônio – APS (polimerizador) - , 16 µL de TEMED – N,N,N’,N’- tetrametiletileno diamino (catalisador) -, e 100 µL do corante para visualização do gradiente de desnaturação (azul de bromofenol 0,5 %, xileno cianol 0,5 % e TAE 1X). O gel foi mantido no estande de montagem para polimerização. A eletroforese foi conduzida em temperatura de 60ºC e voltagem constante de 50 V, durante 16 horas, condições estas consideradas as mais adequadas para as amostras em estudo. Ao término da eletroforese, o gel foi corado por 20 minutos com solução 1X de SYBR GOLD ® (Sigma-Aldrich), conforme as recomendações do fabricante. A imagem do gel sob luz UV foi capturada e digitalizada pelo Eagle Eye (II Still Video System) (Stratagene – Califórnia USA).
4.3.5.4. Análise da diversidade genética
A análise da diversidade genética foi realizada utilizando-se da imagem do perfil do gel obtido pela técnica DGGE, na forma de arquivos digitais (padrão Tiff), com o auxílio do programa Gel Pro Analyser® 3.1 (Media Cybernetics Inc., Maryland-USA). Essas análises foram realizadas para o arquivo digital correspondente a cada gel, ou seja, a cada uma das amostras de lodo biológico. Os ajustes básicos do programa foram os seguintes:
- largura da raia: 10 pixels; - altura mínima de banda: 2%;
- separação mínima de bandas: 0,5% Rf; - raias retilíneas;
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- correção de Background: nenhuma.
Dessa forma, e de modo interativo, as raias foram posicionadas e as bandas identificadas. É importante registrar que esses ajustes foram os que propiciaram a maior concordância entre as bandas detectadas pelo programa e as bandas detectadas visualmente, sendo, estas últimas, observações realizadas em imagens de fundo claro e bandas escuras. Obtidos os valores para os ajustes referidos, nos poucos casos em que as bandas detectadas pelo programa não correspondiam àquelas detectadas visualmente, utilizou-se o recurso do programa para adição ou exclusão manual de bandas.
A diversidade de uma comunidade microbiana é função de dois componentes: o número total de diferentes classes, chamada de “Riqueza” e o índice de diversidade (NÜBEL et al., 1999). No perfil eletroforético, obtido pela técnica de DGGE, as bandas exibidas podem não corresponder às diferentes espécies bacterianas, uma vez que várias espécies bacterianas possuem múltiplas cópias do 16S rDNA (diferentes operons rrN) com seqüências que apresentam microheterogeneidade e, assim, podem ser discriminadas pela técnica, resultando no aparecimento da várias bandas para uma mesma espécie (NÜBEL et al., 1996). Desse modo, vários autores referem-se às bandas resultantes do gel de DGGE como unidades taxonômicas operacionais (UTOs). Estas correspondem às classes. Juntas compõem a “Riqueza”. Para medir a diversidade microbiana de comunidades complexas, como as encontradas no solo, faz-se o uso de índices de diversidade, como o Índice de Shannon-Weaver (também denominado Índice de Shannon-Wiener), índice mais comumente utilizado pelos ecologistas. Nele, as classes individuais (componentes da “Riqueza”) são ponderadas pelas suas abundâncias relativas. Este índice estima o grau de incerteza atrelado à identidade (classe a que pertence) de qualquer elemento individual (indivíduo), aleatoriamente selecionado de uma comunidade, o qual aumenta paralelamente à “Riqueza” (NÜBEL et al., 1996; TÓTOLA & CHAER, 2002). O Índice de Diversidade de Shannon-Weaver apresenta valores mais altos na medida em que o número de elementos individuais está mais uniformemente distribuído entre as classes, Por exemplo, as UTOs existentes em dada comunidade.
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Diferentes comunidades podem apresentar o mesmo índice de diversidade, porém, podem ser distintamente divergentes quanto a sua “Riqueza” (TÓTOLA & CHAER, 2002).
A estrutura da comunidade microbiana, presente nas amostras de lodo biológico, de acordo com o resultado da técnica de DGGE, foi avaliada com base nas seguintes variáveis: Riqueza (R) e Índice de Diversidade de Shannon-Weaver (H’) (ATLAS & BARTHA, 1998; DILLY et al., 2004).
A variável R foi obtida com base em uma matriz binária, na qual a ausência da banda, correspondente a cada UTO, era codificada como zero (0) e a presença, como um (1). Para cada temperatura, obteve-se a freqüência de ocorrência de cada UTO pela contagem do número de presenças. O índice H’ foi calculado com base na abundância, expressa como densidade ótica da banda na raia do gel, pela seguinte Equação 1.
H’= 2,3/N (N log N -Σ ni log ni) (1) Onde:
N = densidade ótica da raia, obtida pelo somatório das densidades óticas das bandas da raia;
ni= densidade ótica de cada banda, na raia.