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Através da abordagem de pirosequenciação pelo equipamento 454 life science, foram identificadas 10 possíveis alterações nos exões 19, 22, 24, 26 e 29 do gene APOB. De forma a verificar a patogenicidade das alterações foram realizados estudos funcionais em células U937, HepG2 e linfócitos. Uma vez que estes ensaios são realizados com as partículas de LDL dos doentes, não foi possível verificar a patogenicidade de todas as alterações tendo sido apenas estudados os portadores de 4 destas alterações p.Asp1113His, p.Arg1164Thr, p.Tyr1247Cys e p.Gln4494del se mostraram disponíveis para realização de uma nova colheita. Os estudos funcionais das variantes p.Arg1164Thr e p.Gln4494del mostraram existir uma redução de cerca de 40% na ligação da partícula de LDL ao recetor das LDL, assim como na internalização do complexo LDL:LDLR, quando comparados com wild type. O mesmo foi observado no ensaio com as células U937, onde se verificou uma redução de 50% na proliferação celular, quando comparadas com wild type. Os resultados dos estudos funcionais demonstraram que as alterações originavam uma diminuição da ligação da partícula de LDL ao seu recetor, sendo esta diminuição semelhante ao controlo APOB3527. O estudo funcional das alterações p.Asp1113His e p.Tyr1247Cys revelou que as mesmas não são patogénicas, como esperado, uma vez que se verificou que ambas não co- segregam na família com a hipercolesterolemia e apresentavam uma frequência de 2% num painel de normolipidémicos (Alves et al. 2013). Também as alterações p.Asp2213del e p.Ser3279Gly deverão ser polimorfismos, uma vez que estão presentes

com uma frequência de 1-2% num painel de normolipidémicos. Todas as alterações foram verificadas quanto à sua presença num painel de 96 CI com diagnóstico clínico de FH mas sem uma alteração num dos 3 genes associados à FH, tendo-se verificado a presença das alterações p.Asp1113His e p.Ser3279Gly em 5 destes CI (Alves et al. 2013). O estudo funcional das restantes 4 alterações estão programados para futuros trabalhos (Figura IV.1).

Neste trabalho foram utilizados 3 tipos de células diferentes de forma a validar os resultados obtidos, tendo sido o ensaio nas células U937 considerado o melhor método por ser o que apresenta menos erros associados a todo o procedimento e por isso maior fiabilidade de resultado (Alves et al. 2013). Estudos anteriores desenvolvidos por Van der Broek et al. indicam que a sensibilidade e especificidade deste método é de 87,5% e 100%, respetivamente (Van den Broek et al. 1994). Os estudos funcionais em alterações no gene APOB em linfócitos foram realizados pela primeira vez no âmbito deste trabalho (Alves et al. 2013).

A mutação p.Arg1164Thr no gene APOB encontrada neste trabalho não se situa na região consensus de ligação do ligando ao LDLR, nem na região posteriormente proposta por Krisko e Etchebest (Krisko and Etchebest 2007). No entanto os resultados dos ensaios funcionais demonstraram que esta alteração origina uma diminuição na afinidade da partícula LDL para o seu recetor. Encontra-se descrito na literatura que alterações no gene APOB que leva à substituição de em resíduos de arginina causa m diminuição da afinidade do complexo LDL:LDLR (Mahley et al. 1977; Weisgraber et

al. 1978; Mahley et al. 1979) podendo ser esta a explicação neste caso. Tal como

acontece com a mutação mais comum APOB3527, também este aminoácido pode ser importante para a correta conformação da proteína alterando-a e diminuindo a afinidade para o recetor das LDL. O facto de se ter verificado baixa penetrância nos indivíduos mais jovens da família do CI 25023 pode também estar relacionado com a idade, como acontece na dislipidemia familiar combinada (Brouwers et al. 2012).

A mutação p.Gln4494del encontra-se na cauda da proteína APOB, numa zona importante para a sua correta conformação e estabilidade à superfície da partícula de LDL. Esta alteração foi encontrada no CI 28120 e alguns dos seus familiares ( Figura III.2.10), tendo-se verificado existir uma baixa penetrância em alguns indivíduos. Contudo ao contrário do verificado na família 25023, a baixa penetrância não parece estar relacionada com a idade, podendo dever-se com outros fatores genéticos e/ou

ambientais. Nesta família verificou-se que a avó materna (I:2, Figura III.2.10) do CI tinha um fenótipo de hipercolesterolemia mas não apresentava a alteração no gene

APOB. Uma vez que existia causa de baixa penetrância e a alteração se situava numa

zona onde nunca tinham sido descritas alterações no gene APOB, foi sequenciado o exoma do CI, de forma a encontrar a explicação para o fenótipo apresentado nesta família. Identificou-se por esta técnica o polimorfismo p.Asp19His (rs11887534) no gene ABCG8, estando este associado a formação de cálculos biliares de colesterol (Buch

et al. 2007). Os transportadores ABC são proteínas transmembranares que facilitam o

transporte de substratos específicos através da membrana celular. Nos eucariotas , os transportadores ABC encontram-se divididos em 7 subgrupos com base na sua sequência e organização (Dean and Allikmets 1995). Entre estes transportadores ABC, encontram-se o ABCG5 e ABCG8 que são proteínas que formam heterodímeros funcionais, localizados na membrana apical dos enterócitos e membranas canaliculares dos hepatócitos, agindo como exportadores eficientes de colesterol para a bílis (Yu et al. 2005). O ABCG8 encontra-se também no epitélio das vesículas biliares e um aumento da sua expressão está associado a litíases biliares (cálculos biliares) (Yoon et al. 2010). Estas desenvolvem-se quando a bílis contém excesso de colesterol e quantidade insuficiente de sais biliares. Segundo Buch et al. este polimorfismo (rs11887534) aumenta a eficiência do transporte de colesterol do fígado para a bílis ocorrendo saturação de colesterol e consequentemente cálculos biliares (Buch et al. 2007). Este polimorfismo encontra-se descrito na literatura como estando associado a um aumento da suscetibilidade de desenvolver litíases biliares de colesterol, bem como um aumento dos níveis plasmáticos de colesterol LDL, sendo esta suscetibilidade maior nas mulheres (Chen et al. 2008; Srivastava et al. 2010). Os familiares I:2, I:1, II:2, bem como o CI (III.1), apresentam este polimorfismo tendo-se verificado que o colesterol total e LDL é mais elevado nos familiares do sexo feminino (Figura III.2.10). A avó

materna (I:2) efetuou uma colecistectomia (exérese da vesícula) há poucos anos, o que

reforça a ideia que este polimorfismo possa afetar mais o transporte de colesterol do fígado para a bílis nas mulheres justificando um aumento dos níveis plasmáticos de colesterol total e LDL (Buch et al. 2007; Chen et al. 2008; Srivastava et al. 2010; Alves

et al. 2013). O estudo do exoma nesta família, permitiu uma melhor caracterização do

perfil lipídico explicando a falta de co-segregação do fenótipo com a alteração no gene no gene APOB.

Para melhor compreender a baixa penetrância verificada nas duas famílias, foram também realizados estudos moleculares a todos os exões do gene PCSK9, a um fragmento do gene APOC3 contendo a alteração p.Arg19X, foi caracterizado o genótipo

APOE de todos os indivíduos para despiste de alterações que causam

hipocolesterolemia. Os resultados obtidos não explicam o fenótipo mais suave verificado nestas famílias.

Em 2012 Motazacker et al (Motazacker et al. 2012) reportaram 2 novas mutações no gene APOB (p.Arg3059Cys e p.Lys3367Asn) em doentes com FH clínica que não apresentavam co-segregação completa, observando-se casos de baixa penetrância. Estas alterações no gene APOB estão localizadas fora da região consensus de ligação do ligando ao recetor das LDL (aminoácidos 3386 ao 3396), mas localizam-se na região postulada por Krisko e Etchebest (Krisko and Etchebest 2007), situação diferente das 2 outras alterações reportadas neste trabalho. Após o estudo funcional em células HepG2, estes autores observaram uma redução de 28% para a mutação p.Arg3059Cys e de 49% para a mutação p.Lys3367Asn na internalização das partículas quando comparados com

wild type (Motazacker et al. 2012). No entanto estes autores apenas realizaram estudos

funcionais nos CI e em células HepG2, abordagem diferente da utilizada neste trabalho de doutoramento, onde se realizou o ensaio funcional em 3 tipos de células diferentes de modo a validar os resultados. Além disso, no presente trabalho, foram também, realizados estudos funcionais em familiares o que não é uma abordagem comum, mas importante para reforçar os resultados obtidos.

Como referido anteriormente, a penetrância das alterações nas famílias dos casos índex 25023 e 28120 não era total, ou seja, existiam indivíduos com a alteração mas se m fenótipo de FH (Alves et al. 2013). Estes resultados são coerentes com o descrito na literatura, que referem que mutações no gene APOB associadas à FH não apresenta m uma penetrância de 100%, assim como doentes com mutações no gene APOB apresentam, usualmente, um fenótipo moderado da doença (Myant 1993; Vrablík et al. 2001). É sabido que mutações no gene APOB impedem ou diminuem a ligação do complexo LDL:LDLR. No entanto pode ocorrer um mecanismo compensatório do LDL ao LDLR através da apoE, assim como um aumento na internalização da VLDL remanescente, originando um fenótipo mais suave nos doentes com estas alterações. É sabido que a remoção das lipoproteínas de densidade intermédia (IDL) da corrente sanguínea continua a ser efetuada através da apoE, mas as partículas small dense LDL

(sdLDL) continuam em circulação. Sendo estas partículas altamente aterogénicas, apesar dos doentes não apresentarem um fenótipo típico de FH, apresentam um risco aterogénico elevado e consequentemente risco de desenvolver uma DCV prematura (Nigon et al. 1991; März et al. 1993).

Apenas uma parte dos doentes com mutações no gene APOB cumprem os critérios clínicos de FH (Miserez and Keller 1995), mas a não inclusão destes doentes e m estudos moleculares podem excluir doentes com mutações no gene APOB que apresentam um risco elevado de desenvolverem uma doença cardiovascular. Uma vez que todo o gene da APOB não é estudado por rotina, os resultados de Motazacker e os apresentados neste trabalho, indicam que provavelmente a APOB deve conter mais mutações patogénicas fora da região consensual que não estão a ser identificadas, já que a prática comum na rotina laboratorial é a análise dos fragmentos que contem as 4 alterações mais comuns, ou seja estudo molecular a um fragmento do exão 26 e outro do exão 29. Com base nestes resultados o estudo de todo o gene APOB deveria ser incluído no diagnóstico molecular da FH. Com o desenvolvimento de novas plataformas, será possível incluir a sequenciação de todo o gene APOB num diagnóstico molecular de FH através de pirosequenciação, sem aumentar o custo do diagnóstico. A implementação deste método está a ser neste momento desenvolvida no nosso laboratório.