Generell modell

2.1 ESTOMATITE PROTÉTICA ... 31 2.2 FUNGO Candida albicans ... 33

2.3 MECANISMO DE INVASÃO PELO FUNGO Candida

albicans ... 34 2.4 MORTE EPITELIAL: APOPTOSE CELULAR ... 36 2.5 INTERAÇÃO ENTRE EPITÉLIO E Candida albicans ... 37 2.6 ÓXIDO NÍTRICO (NO) ... 40 2.7 PEPTÍDEO β-DEFENSINA HUMANA (hBD) ... 41 3 PROPOSIÇÃO ... 45 3.1 OBJETIVO GERAL ... 47 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 47 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 49 4.1 OBTENÇÃO DAS CÉLULAS ... 51 4.1.1 Células epiteliais de mucosa bucal de palato humano ... 51 4.1.1.1 Amostras da mucosa bucal de palato humano ... 51 4.1.1.2 Desinfecção da mucosa bucal de palato humano coletada ... 51 4.1.1.3 Obtenção das células epiteliais pelo método explante ... 52 4.1.1.4 Obtenção das células epiteliais pelo método enzimático ... 57 4.1.2 Fibroblastos gengivais humanos para a camada de

sustentação (feeder-layer) ... 57 4.1.3 Preparação da camada de sustentação ... 58

4.2 CO-CULTIVO DAS CÉLULAS EPITELIAIS DE MUCOSA

BUCAL DE PALATO HUMANO SOBRE A CAMADA DE

FEEDER-LAYER ... 59 4.3 MANIPULAÇÃO DO FUNGO Candida albicans 90028 ... 63

4.4 DESAFIO DAS CÉLULAS EPITELIAIS DE MUCOSA

4.4.1 Desafio direto (D.D.) ... 64 4.4.2 Desafio indireto (D.I.) ... 64 4.5 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR ... 64

4.6 AVALIAÇÃO QUALITATIVA DA INVASÃO DA CÉLULA

EPITELIAL PALATAL PÓS-DESAFIO DIRETO COM O

FUNGO Candida albicans ... 65 4.7 ENSAIO DE APOPTOSE CELULAR ... 66 4.8 ENSAIO DE LIBERAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) ... 66

4.9 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO GÊNICA

DO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO hBD-2 (RT-qPCR) ... 67 4.10 ANÁLISE DOS RESULTADOS ... 68 5 RESULTADOS ... 71

5.1 VIABILIDADE DAS CÉLULAS EPITELIAIS DE PALATO

HUMANO ... 73

5.2 INVASÃO DAS CEPH PELO FUNGO Candida albicans

APÓS O DESAFIO DIRETO ... 85

5.3 APOPTOSE DAS CEPH APÓS DESAFIO COM O

FUNGO Candida albicans ... 91

5.4 LIBERAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) IN VITRO PELAS

CÉLULAS EPITELIAIS DE PALATO HUMANO ... 97

5.5 EXPRESSÃO GÊNICA DO PEPTÍDEO

ANTIMICROBIANO hBD-2 (RT-qPCR) ... 101 6 DISCUSSÃO ... 107 7 CONCLUSÕES ... 121 REFERÊNCIAS ... 125 APÊNDICES... 139 ANEXOS ... 145

Introdução 27

1 INTRODUÇÃO

A estomatite protética é a lesão mais frequente em usuários de próteses dentárias removíveis, sendo uma doença inflamatória que acomete a mucosa bucal palatal e alveolar que se encontra em íntimo contato com o acrílico da superfície interna das próteses, principalmente totais superiores (BERDICEVSKY et al., 1980; FOTOS; HELLSTEIN; VINCENT, 1991; DARWAZEH; AL-REFAI; AL-MOJAIWEL, 2001). A incidência desta doença, em pacientes usuários de próteses totais no Brasil, está entre 19,5% e 50,6% (PIRES et al., 2002; MARCHINI et al., 2006), sendo diagnosticada, principalmente, em indivíduos na faixa etária entre 50 e 60 anos, com prevalência do gênero feminino (PEREIRA, 2007) e maior acometimento da mucosa palatal (CATALÁN et al., 2008). Doença decorrente de uma etiologia multifatorial, a estomatite protética está fortemente relacionada com a presença do fungo Candida albicans (C. albicans), em especial na superfície interna resinosa das próteses (REICHL, 1990; FARAH; ASHMAN, CHALLACOMB, 2000; OLIVEIRA et al., 2010), bem como com fatores sistêmicos, como doenças endócrinas e depressão da resposta imune (ABIKO et al., 2007; WEINDL; WAGENER; SCHALLER, 2010), muito comum em indivíduos idosos (PEREIRA, 2007; GASPAROTO et al., 2004; GASPAROTO et al., 2012).

Encontrada nas formas levedura e hifa, C. albicans leveduriforme vive em comensalismo com indivíduos saudáveis (REICHL, 1990). A mudança dessa condição comensal para patogênica envolve a transição da forma levedura para hifa. Estrutura filamentosa, a forma hifal cresce por alongamento, com capacidade de penetrar nos tecidos bucais, sendo sugerida como a morfologia responsável pelo início da reação inflamatória na estomatite protética (GOW; BROWN; ODDS, 2002; LU et al., 2006; MALIC et al., 2007). A interação in vitro fungo-epitélio passa por fases como aderência, invasão e dano celular (WEINDL et al., 2007; ZAKIKHANY et al., 2007), com a ativação dos mecanismos apoptóticos celulares por C. albicans auxiliando na promoção da patogênese fúngica (VILLAR; ZHAO, 2010; WAGENER et al., 2012).

Apesar dos danos provocados pela penetração das hifas nas células, o epitélio, por sua vez, tenta controlar o crescimento da célula fúngica e a invasão tecidual (WEINDL et al., 2007). Em um primeiro momento, o epitélio bucal funciona

28 Introdução

como uma barreira mecânica resistente de forma passiva às infecções microbianas. Além dessa proteção passiva, as células epiteliais respondem ativamente, por meio de um processo inflamatório, secretando citocinas e quimiocinas que interagem com vários tipos celulares para ativação da resposta imune inata e, posteriormente, resposta imune adaptativa (ABIKO et al., 2007; DÉCANIS; SAVIGNAC; ROUABHIA, 2009; WEINDL; WAGENER; SCHALLER, 2010).

Com enfoque na imunidade inata em resposta a presença de microrganismos patogênicos, as células epiteliais produzem, além das citocinas, moléculas antimicrobianas que podem contribuir com o combate do patógeno antes da infecção se instalar (SEO et al., 2002; LU et al., 2006; ABIKO et al., 2007; WEINDL; WAGENER; SCHALLER, 2010). Os peptídeos antimicrobianos β- defensinas (hBD) destacam-se por serem secretados por queratinócitos da mucosa bucal (DALE; FREDERICKS, 2005; PEYRET-LACOMBE et al., 2007) e apresentarem atividade antifúngica contra C. albicans (VYLKOVA; SUN; EDGERTON, 2007; VYLKOVA et al., 2007), além de participarem da modulação das respostas imunes inata e adaptativa contra vários patógenos bucais (DOSS et al., 2010). O óxido nítrico (NO), sintetizado por diversas células, incluindo queratinócitos, também é produzido em resposta à infecção microbiana (SEO et al., 2002), com um papel importante na defesa do hospedeiro contra C. albicans pela destruição celular direta ou formação de ânions (NAKAI; KUBOTA; KOSAKA, 2004). Além disso, recentemente, NO foi descrito como um potente agente microbicida contra infecções bucais (GASPAROTO et al., 2012).

Poucos dados na literatura referem-se ao estudo da participação de células epiteliais nas candidoses bucais, incluindo a estomatite protética. Não são encontrados estudos com células epiteliais de palato humano (CEPH), nem tampouco que avaliem a relação simultânea entre a agressão do epitélio pelo fungo C. albicans e as respostas epiteliais de defesa diante desse microrganismo. Avanços no conhecimento da participação das CEPH no combate à C. albicans são importantes para um maior esclarecimento dos aspectos biopatológicos destas células, pricipalmente quando afetadas pela estomatite protética, bem como das respostas de defesa imune inata nesta doença. Assim, o presente estudo avaliou in vitro o efeito do contato direto e dos produtos secretados pelo fungo C. albicans, sobre as CEPH ao longo do tempo.