A empresa Tosoh Bioscience com sede no Japão e com filiais na Alemanha e Estados Unidos comercializam resinas acrílicas de afinidade chamadas Toyopearl com diferentes propriedades para processos de separação e purificação de compostos orgânicos,
15 normalmente proteínas (www.tosohbioscience.com). Estas resinas apresentam diferentes grupos químicos em sua estrutura com o objetivo de se ligarem em diferentes grupos reativos. Estas resinas são hidrofílicas, com alta porosidade para que possa acomodar proteínas de alta massa molecular, aproximadamente 1000 Ǻ de diâmetro de poros, e diâmetros de partículas da ordem de 40-90 m, com aplicações em escalas laboratorial e industrial. Elas podem ser empregadas na síntese de peptídeos e oligonucleotídeos devido à sua excelente estabilidade em diferentes solventes orgânicos e em condições extremas de pH. De acordo com o catálogo informativo fornecido pela Tosoh Bioscience, estas resinas são divididas em três classes; resinas ativadas que não necessitam de reagentes químicos para a estabilização do complexo resina/ proteína; resinas específicas que possuem mecanismos de ligação distintos (quelação e adsorção) e resinas reativas que necessitam destes agentes na estabilização do complexo.
Resinas ativadas Toyopearl AF-Tresil-650M e Toyopearl AF-Epóxi-650M possuem em sua estrutura cerca de 20 moles de grupos tresil e ≥ 100 moles de grupos epóxi.mL-1 de resina úmida. Estas resinas sofrem ataque nucleofílico de grupos amino e tiol de proteínas ideais na imobilização de proteínas, carboidratos e glicoproteínas. Resinas específicas Toyopearl AF-Quelato-650M, Toyopearl AF-Blue HC-650M e Toyopearl AF- Red-650M são bastante empregadas na purificação de polimerases, ciclases, transferases e albumina. Resinas reativas são representadas por Toyopearl AF-Carbóxi-650M, Toyopearl AF-Formil-650M e Toyopearl AF-Amino-650M. Estas resinas possuem alta densidade de grupos reativos em sua estrutura e também são empregadas em processos de purificação e separação de diferentes proteínas, conforme mostrado na Tabela 2.2.
Estas resinas se ligam covalentemente aos grupos reativos da enzima e requerem agentes químicos para estabilizar as ligações AF-Formil-650M e AF-Amino-650M que necessitam de cianoborohidreto de sódio para reduzir as bases de Schiff (ligações iminas) após reação covalente com a proteína para a obtenção de um derivado inerte e AF-Amino- 650M e AF-Carbóxi-650M necessitam de carbodi-imida.
16 Tabela 2.2. Concentração de proteína imobilizada em diferentes resinas acrílicas comercializadas pela empresa Tosoh Bioscience.
PI (mg.mL-1 de gel) AF-Tresil- 650M AF-Formil- 650M AF-Amino- 650M AF-Carbóxi- 650M Inibidor de Tripsina de Soja 16,0 3,50 5,80 15,0
Concanavalina A 13,0 - - -
α-Quimotripsina 12,5 - - -
Mioglobina 12,4 - - -
Ovalbumina - 2,50 6,70 0,80
Albumina de Soro Bovina 12,4 14,0 19,2 3,30
Imunoglobulina Humana 10,0 15,0 6,70 11,7
Lisozima 60,0 20,0 5,80 17,5
PI: Proteína Imobilizada (mg.mL-1 de gel). Fonte: www.tosohbioscience.com
A resina AF-Amino-650M possui cerca de 90 moles de grupos amino.mL-1 de resina úmida e diâmetro de partícula e poro de 6500 e 1000 Ǻ, respectivamente, e estabilidade em uma ampla faixa de pH (2-13), condições ideais em processos de imobilização de enzimas (www.separations.us.tosohbioscience.com). Este suporte apresenta também grupos hidroxilas que podem ser importantes no processo de imobilização, como mostrado na Figura 2.3.
Figura 2.3. Estrutura química da resina acrílica Toyopearl AF-Amino-650M.
Diferentes agentes de ativação como glicidol e epicloridrina reagem preferencialmente com os grupos hidroxila, produzindo géis glioxil e os grupos amino podem reagir com glutaraldeído, um agente bifuncional bastante empregado em técnicas de imobilização, o que torna interessante o uso desta resina como matriz de imobilização de enzimas. Outra importante característica é a sua elevada capacidade de adsorver corantes hidrofóbicos (rosa de bengala), mostrando ter caráter hidrofóbico (Mendes et al., 2008a). De acordo com a literatura, o uso desta resina no processo de imobilização de lipases não é relatado. Apesar de suas excelentes propriedades, este suporte apresenta um custo bastante elevado, US$ 530,00 o frasco contendo 100 mL de resina, tornando inviável a sua aplicação em biotransformações em escala industrial.
17 2.3.2. Poli-Hidróxibutirato (PHB)
Poli-hidróxibutirato (PHB), um derivado da família dos poli-hidróxialcanoatos (PHA) são poliésteres estruturalmente simples, sintetizados por muitos micro-organismos como substâncias naturais de reserva de carbono e de energia (Squio e Aragão, 2004). São acumulados pela célula microbiana em forma de grânulos, podendo chegar até 90% em massa seca (Kai et al., 2003). Estes biopolímeros são produzidos em condições de crescimento não balanceadas proporcionadas pela limitação de um nutriente, entre outros, como fonte de nitrogênio e fósforo e excesso da fonte de carbono (Squio e Aragão, 2004). Mais de 100 monômeros diferentes já foram identificados como constituintes de PHA sintetizados por organismos naturais ou recombinantes, o que demonstra a grande diversidade de PHA que podem ser produzidos (Kai et al., 2003; Squio e Aragão, 2004). Entre os PHA mais estudados e produzidos industrialmente, estão o poli-hidróxibutirato (PHB) e o poli-hidróxibutirato-co- hidróxivalerato (PHB-co-HV) (Kai et al., 2003).
Na literatura são reportadas diversas linhagens empregadas na produção de poli-hidróxialcanoatos, especialmente PHB, tais como Ralstonia eutropha que tem sido utilizada na produção industrial, por apresentar elevada produção e em alto rendimento do biopolímero. Entretanto, a linhagem original (Alcaligenes eutrophus H16) só utiliza alguns tipos de açúcares e, embora espécies mutantes (R. eutropha DSM 545, Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599) possam crescer em glicose, não podem hidrolisar sacarose. Outro microorganismo com grande potencial para a produção industrial é Burkholderia sacchari, isolado de solo de canavial brasileiro (Squio e Aragão, 2004).
O PHB pode ser utilizado como matéria-prima em um amplo campo de aplicações, como embalagens para produtos de limpeza, higiene, cosméticos e alimentos (Squio e Aragão, 2004). Também servem para produzir sacos descartáveis, vasos para crescimento de mudas, brinquedos e material escolar. Além disso, por serem biocompatíveis podem ser empregados na área médico-farmacêutica em fabricação de fios de sutura, próteses ósseas, suportes de culturas de tecidos para implantes e encapsulação de fármacos para liberação controlada (Kai et al., 2003; Squio e Aragão, 2004). Este material apresenta alta cristalinidade e hidrofobicidade (Kai et al., 2003). Por se tratar de um material biodegradável e de caráter hidrofóbico, torna-se um material promissor na imobilização de enzimas,
18 especificamente lipases (Mendes et al., 2008d). Porém a sua aplicação como matriz para a imobilização de enzimas ainda não é relatada na literatura.