4. DISKUSJON
4.4 Fysioterapeutens rolle
A Figura 7 e Figura 8 ilustram cromatogramas típicos HPLC-DAD com e sem líquido iônico como aditivo, respectivamente para a mistura das 16 aminas classificadas no grupo 1: 4,4'-oxidianilina, anilina, 2,4-diaminotoluidina, 3,3'- dimetoxibenzidina, 4,4'-diaminobifenila, 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina, 2-
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aminonaftaleno, 2-metilanilina, 2-metoxianilina, 4,4-diaminodifenilmetano, 3,3’- dimetilbenzidina, 2-cloro-4-nitroanilina, 4-aminobifenila, 2-metoxi-5-metilanilina, 4- cloroanilina e 3,3’-diclorobenzidina, utilizando como fase móvel metanol/água 70:30 (v/v) e vazão de 0,8 mL min-1 para o sistema HPLC-DAD com e sem adição de líquido
iônico. O cromatograma foi registrado para detecção em comprimento de onda de 230nm.
Figura 7: Cromatogramas HPLC-DAD obtidos para 20L da mistura dos padrões de aminas do
grupo 1 em concentração de 50 mg L-1 em metanol, Fase móvel: metanol/água 70:30 (v/v), = 230nm, fase estacionária C18.
a: 4,4'-diaminodifenilmetano; b: 4-cloroanilina; c: 2-metoxi-5-metilanilina; d: 3,3'-
dimetilbenzidina; e: 2,4-diaminotoluidina; f: 2-cloro-4-nitroanilina; g: 4,4-oxidianilina; h: anilina; i: 3,3'-diclorobenzidina; j: 4,4'-diaminobifenila; k: 4-aminobifenila; l: 3,3'-dimetoxibenzidina; m:
2-metoxibenzidina; n: 2-metilanilina; o: 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina; p: 2-aminonaftaleno.
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Figura 8: Cromatograma HPLC-DAD a partir da injeção de 20L da mistura dos padrões de
aminas do grupo I na concentração de 50mg L-1 em metanol utilizando BMIm-NTf2 como
aditivo à fase móvel, = 230nm.
a: 4,4'-diaminodifenilmetano; d: 3,3'-dimetilbenzidina; c: 2-metoxi-5-metilanilina; b: 4-
cloroanilina; e: 2,4-diaminotoluidina; f: 2-cloro-4-nitroanilina; g: 4,4-oxidianilina; k: 4-
aminobifenila; i: 3,3'-diclorobenzidina; j: 4,4'-diaminobifenila; h: anilina; l: 3,3'-
dimetoxibenzidina; m: 2-metoxianilina; n: 2-metilanilina; p: 2-aminonaftaleno; o: 4,4’-metileno-
bis-2-cloroanilina.
A Figura 7 mostra que exceto pela co eluição da 2-cloro-4-nitroanilina e de 4,4'- oxidianilina com tempo de retenção de 11,30 minutos, todas as outras aminas foram eluidas em tr = 6,48 minutos para a 4,4'-diaminodifenilmetano; tr = 7,42 minutos para a 4-cloroanilina; tr = 8,61 minutos para 2-metoxi-5-metilanilina; tr = 9,09 minutos para a 3,3'-dimetilbenzidina; tr = 10,6 minutos para a 2,4-diaminotoluidina; tr= 12,43 minutos para a anilina; tr = 13,60 minutos para a 3,3'-diclorobenzidina; tr = 15,97 minutos para a 4,4'-diaminobifenila; tr= 16,53 minutos para a 4-aminobifenila; tr= 17,40 minutos para a 3,3'-dimetoxibenzidina; tr= 17,95 minutos para a 2-metoxibenzidina; tr = 18,59 minutos para a 2-metilanilina; tr = 20,41 minutos para a 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina; tr = 21,44 minutos para a 2-aminonaftaleno. No entanto, observa-se que alguns compostos como 4-aminobifenila, 3,3'-dimetoxibenzidina e 4,4'-metileno-bis-2-cloroanilina apresentaram um pequeno encaudamento dos picos.
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Para contornar estes problemas utilizou-se a adição de líquido iônico à fase móvel, com o intuito de formar par iônico com o analito e assim alterar as interações entre o analito e a fase estacionária. Assim, foi adicionado à fase móvel 30 mmol L-1
líquido iônico BMIm-NTf2, e o correspondente cromatograma esta mostrado na Figura 8, no qual as condições cromatográficas otimizadas foram: Fase móvel: MeOH/água + 30 mmol L-1 DE BMIm-NTf2 70:30 (v/v), T = 40°C, vazão = 0,80mL min-1; fase
estacionária C18, monitorando o comprimento de onda de 230 nm para o detector de arranjos de diodo. Analisando a Figura 8 observa-se a melhor separação cromatográfica dos compostos analisados, além de ausência de encaudamento dos picos.
Comparando as Figura 7 e Figura 8 pode-se verificar que houve mudança na ordem de eluição dos compostos: 3,3'-dimetilbenzidina, 4-cloroanilina, 4-aminobefenila, anilina, 2-aminonaftaleno e 4,4'-metileno-bis-2-cloroanilina, que pode ser explicado pela alteração no mecanismo complexo que ocorre na coluna cromatográfica onde há formação de par iônico entre a amina protonada (carga positiva) e o ânion [NTf2]- do
líquido iônico. O metanol apresenta uma constante de dissociação baixa, insuficiente para formar par iônico com o analito protonado. Sendo assim, o mecanismo que ocorre durante a analise cromatográfica se torna diferenciado obtendo por fim um cromatograma mais resolvido e limpo. O pKa das aminas aromáticas tem grande influencia na separação cromatográfica, pois como o pH da fase móvel é aproximadamente 7,0 e neste pH algumas aminas (ver Tabela 1) apresentam-se protonadas no meio e devido a isto irão formar par iônico com os ânions [NTf2]- do
líquido iônico utilizado como aditivo alterando o mecanismo de separação e devido a isso ocorreu inversão da ordem de eluição de algumas aminas assim como a dimuição ou aumento do tempo de retenção de algumas aminas. As aminas aromáticas que apresentam pKa
Na Figura 9 são melhor comparados os cromatogramas HPLC-DAD com e sem líquido iônico onde as intensidades dos picos são comparadas em 3D.
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Figura 9: Cromatograma comparativo em 3D da aminas do grupo 1 na ausência (curva B,
vermelha) e na presença do líquido iônico BMIm-NTf2 (curva A, preta) utilizando detecção de
arranjos de diodos. Fase móvel: MeOH/água + 30 mmol L-1 de BMIm-NTf
2 70:30 (v/v), T =
40°C, vazão = 0,80mL min-1; fase estacionária C18, = 230nm.
Fonte: Próprio autor.
Na analise da Figura 9 observa-se facilmente que a intensidade do sinal também aumenta em médio 30% (altura do pico) quando o líquido iônico foi adicionado à fase móvel pois os íons presentes do líquido iônico bloqueiam os silanóis residuais presentes na fase estacionária da coluna cromatográfica, sendo assim, diminui o tempo de residência destes analitos dentro da coluna e portanto diminui o encaudamento dos picos cromatográficos, ou seja, os picos ficam mais finos (menor largura de base) e por consequência mais intensos. A Figura 10 exemplifica o mecanismo de separação cromatográfica quando o líquido iônico está presente como aditivo à fase móvel. As aminas aromáticas estão protonadas (esferas brancas com carga positiva) interagindo com os ânions do líquido iônico [NTf2]- (esferas escuras com carga negativa). A figura
mostra também que ocorre um bloqueio dos silanóis (esferas brancas com carga negativa) pelos cátions do líquido iônico (esferas escuras com carga positiva). Outro fator importante promovido pela adição do líquido iônico é a formação de par iônico entre as aminas aromáticas protonadas e os íons do líquido iônico. Este fenômeno promove a menor interação dos analitos com o C18 da fase estacionária e leva que ocorra eluição mais rápida da coluna refletindo no aumento da sensibilidade do método.
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Figura 10: Esquema do mecanismo de separação no interior da coluna cromatográfica.
Fonte: [92]
4.2.2. HPLC-ED
Com o intuito de melhorar a sensibilidade do método foi realizado estudo com o detector eletroquímico. A Figura 11 mostra o gráfico de corrente em função do potencial no intervalo de 0,5 a 1,2 V aplicado na célula eletroquímica do sistema HPLC- ED, utilizando-se 20 µL dos padrões de 50 mg L-1 das aminas em metanol.
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Figura 11: Gráfico de corrente em função do potencial aplicado na célula eletroquímica do
sistema HPLC-ED para as aminas aromáticas do grupo 1. 4,4'-oxidianilina, anilina, 2,4- diaminotoluidina, 3,3'-dimetoxibenzidina, 4,4'-diaminobifenila, 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina, 2- aminonaftaleno, 2-metilanilina, 2-metoxianilina, 4,4-diaminodifenilmetame, 3,3’-dimetilbenzidina, 2-cloro-4-nitroanilina, 4-aminobifenila, 2-metoxi-5-metilanilina, 4-cloroanilina e 3,3’- diclorobenzidina
A análise da Figura 11 mostra que o potencial que apresenta maior corrente para todas as aminas estudadas foi igual a +1,0 V versus Ag/AgCl de fase sólida e assim este potencial foi aplicado na célula para monitoramento desses compostos. As Figura 12 e Figura 13 ilustram cromatogramas típicos HPLC-ED com e sem líquido iônico como aditivo, respectivamente para a mistura das 16 aminas classificadas no grupo 1: 4,4'-oxidianilina, anilina, 2,4-diaminotoluidina, 3,3'-dimetoxibenzidina, 4,4'- diaminobifenila, 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina, 2-aminonaftaleno, 2-metilanilina, 2- metoxianilina, 4,4-diaminodifenilmetame, 3,3’-dimetilbenzidina, 2-cloro-4-nitroanilina, 4- aminobifenila, 2-metoxi-5-metilanilina, 4-cloroanilina e 3,3’-diclorobenzidina, utilizando como fase móvel metanol/água 70:30 (v/v) e vazão de 0,8 mL min-1 para o sistema HPLC-ED sem adição de líquido iônico e fase móvel Metanol/Água + 30 mmol L-1 de
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Figura 12: Cromatograma HPLC-ED obtidos para 20L da mistura dos padrões de aminas do
grupo I em concentração de 50 mg L-1 em metanol em eletrodo de carbono vítreo. Fase móvel:
metanol/água 70:30 (v/v), E= +1,00V. T = 40°C, vazão = 0,80 mL min-1; fase estacionária
C18.a: 4,4'-diaminodifenilmetano; b: 4-cloroanilina; c: 2-metoxi-5-metilanilina; d: 3,3'-
dimetilbenzidina; e: 2,4-diaminotoluidina; f: 2-cloro-4-nitroanilina; g: 4,4-oxidianilina; h: anilina; i: 3,3'-diclorobenzidina; j: 4,4'-diaminobifenila; k: 4-aminobifenila; l: 3,3'-dimetoxibenzidina; m:
2-metoxibenzidina; n: 2-metilanilina; o: 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina; p: 2-aminonaftaleno.
Fonte : Próprio autor
Figura 13: Cromatograma HPLC-ED a partir da injeção de 20L da mistura dos padrões de
aminas do grupo I na concentração de 50mg L-1 em metanol utilizando BMIm-NTf
2 em eletrodo
de carbono vítreo. E= +1,00V Fase móvel: MeOH/água + 30 mmol L-1 de BMIm-NTf
2 70:30
(v/v), T = 40°C, vazão = 0,80mL min-1; fase estacionária C18.a: 4,4'-diaminodifenilmetame; d:
3,3'-dimetilbenzidina; c: 2-metoxi-5-metilanilina; b: 4-cloroanilina; e: 2,4-diaminotoluidina; f: 2-
cloro-4-nitroanilina; g: 4,4-oxidianilina; k: 4-aminobifenila; i: 3,3'-diclorobenzidina; j: 4,4'-
diaminobifenila; h: anilina; l: 3,3'-dimetoxibenzidina; m: 2-metoxianilina; n: 2-metilanilina; p: 2-
aminonaftaleno; o: 4,4’-metileno-bis-2-cloroanilina.
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Observa-se na detecção eletroquímica os mesmos problemas que ocorreram para a detecção de arranjos de diodos e que foram resolvidos após a adição de líquido iônico. Com o intuito de facilitar a comparação da sensibilidade quando emprega-se líquido iônico como aditivo, a Figura 14 ilustra esse efeito para a detecção eletroquímica.
Figura 14: Cromatograma comparativo em 3D das aminas do grupo 1 na ausência (curva B,
vermelha) e na presença do líquido iônico BMIm-NTf2 (curva A, preta) utilizando DEtecção
eletroquímica. Fase móvel: MeOH/água + 30 mmol L-1 de BMIm-NTf
2 70:30 (v/v), T = 40°C,
vazão = 0,80 mL min-1; fase estacionária C18, E = +1,0V.
Fonte: próprio autor.
Analisando a Figura acima pode-se justificar o aumento da corrente quando usa- se líquido iônico como aditivo da fase móvel pelos mesmos motivos do sistema HPLC- DAD. No entanto, há ainda o efeito dos íons do líquido iônico presentes na fase móvel que aumentam a velocidade da transferência de carga e aumentam a corrente gerada pela facilitação da oxidação das espécies. Neste caso observa-se um aumento de 40% no valor médio da corrente gerada na presença do líquido iônico como aditivo.
4.2.3. Comparação entre a Análise de Aminas Aromáticas do Grupo I por