Fylkesoversikt – biologisk viktige områder

As fosfolipases A2 compõem uma superfamília de enzimas definidas por sua

habilidade de catalisar a hidrólise do éster ligado à posição central (sn-2) de glicerofosfolipidios de membrana celulares, liberando precursores de mediadores químicos relacionadas ao processo inflamatório. Foram descritas cerca de 19 enzimas com atividade fosfolipase em mamíferos, encontradas sob duas formas; intracelular, ou citosólica, e extracelular ou secretória (RANG et al., 2004).

A forma secretória compreende 10 isoenzimas de baixo peso molecular, dependentes de cálcio para atuação e implicadas em processos biológicos como a geração de eicosanóides, na inflamação e defesa do hospedeiro (KUDO; MURAKAMI, 2002). No processo fisiopatológico natural, a forma citosólica, é a principal implicada na liberação do ácido aracdônico (eicosatetraenóico) e, portanto, dos ecosanóides (prostaglandinas, tromboxano A2 s, leucotrienos e lipoxinas), como

também da lisogliceril-fosforilcolina, o precursor de outro mediador inflamatório, o fator de ativação plaquetária (PAF) (RANG et al., 2004). Uma cicloxigenase de ácidos graxos (COX) agindo em seguida à liberação do ácido araquidônico vai metaboliza-lo a prostanóides (prostaglandinas e Tromboxane A2) e uma lipoxigenase

dará origem aos leucotrienos e lipoxinas. O fator de ativação plaquetária (PAF) é originado de um fosfolipídio, lisogliceril-fosforilcolina, que após sofrer a ação da fosfolipase A2 é acetilado pela acetiltransferase (RANG et al., 2004; KUMAR;

ABBAS; FAUSTO, 2005). Compreende três enzimas, das quais a cPLA2α é a mais

implicada no mecanismo do ácido araquidônico, e com ativação finamente regulada pelo cálcio e fosforilação. A fosfolipase independente de cálcio iPLA2 compreende uma família de duas enzimas que participam do remodelamento dos fosfolipídios. A família da acetilhidrolase do fator de ativação plaquetária, PAR-AH, consiste de quatro enzimas cujo substrato específico são o PAF e fosfolipídios oxidados, os quais degrada para inibir o processo inflamatório (KUDO; MURAKAMI, 2002).

Foram classificadas segundo quatro critérios; a) a capacidade de catalisar a hidrólise do éster do substrato fosfolipídico; b) a seqüência completa de aminoácidos; c) a homologia de seqüências; d) a variação no segmento cataliticamente ativo (SIX; DENNIS, 2000).

Na classificação geral das enzimas fosfolipases, as miotoxinas dos venenos das serpentes foram as primeiras identificadas e estão incluídas principalmente no grupo IIA de Six e Dennis (KUDO; MURAKAMI, 2002). Em um mesmo veneno são encontradas uma variedade de PLA2 que podem possuir atividade neurotóxica,

citotóxica, cardiotóxica, miotóxica hipotensiva, proinflamatória, coagulantes ou agregantes de plaquetas, com características moleculares de estrutura quaternária monomérica ou multiméricas, homo ou heterodiméricas, ligadas por pontes dissulfídricas, tóxicos e não tóxicos, cataliticamente ativos ou não. Todas são dependentes de cálcio para atuar e os resíduos da alça de ligação ao cálcio são particularmente conservados.

As miotoxinas fosfolipases A2, foram separadas conforme presença de

atividade neurotóxica ou não (MEBS; OWNBY, 1990). Elas mantêm uma homologia estrutural que se mantém constante dentro de cada grupo. Dentre estas últimas existe uma clara distinção entre as que contêm um ácido aspártico na posição 49, “Asp49”, e as com um resíduo de lisina nesta posição “Lys49” (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003). Um quarto grupo foi constituído pelas toxinas que indiretamente lesam os músculos, como as causadoras de hemorragia, que pela estase provocariam isquemia e necrose secundária (GUTIÉRREZ; CERDAS, 1984).

Aquelas fosfolipases neurotóxicas são comumente encontradas nos venenos elapídicos, sendo as responsáveis pelo seu efeito letal, agindo em doses muito baixas (baixa DL50) na junção neuromuscular, com atividade pre-sináptica (ROSEMBERG, 1990), podendo causar lesão muscular esquelética em doses mais

baixas ainda, de 1-2μg (HARRIS; JOHNSON; KARLSSON, 1975). São também

encontradas em venenos crotálicos, como a crotoxina, de serpentes sul americanas, (HENDON; FRAENKEL-CONRAT, 1971; SALVINI et al., 2001), e em venenos de algumas serpentes botrópicas sendo encontrada no veneno da B. insularis. (COGO et al., 1998).

As miotoxinas fosfolipases A2 não neurotóxicas são muito mais comuns em

doses maiores (alta DL50), (GUTIÉRREZ et al., 1986b; ROSEMBERG, 1990; SOARES, et al., 2000a; SOARES et al., 2001), e tendo menor participação na mortalidade direta destes venenos (LOMONTE; GUTIÉRREZ; MATA, 1985). Seu

potencial mionecrótico também é mais fraco que aquelas PLA2 com ação

neurotóxica, embora, por serem encontradas em maiores quantidades nestes venenos tenham uma participação central na lesão e destruição tissular, causando mionecrose em doses de 25-100μg (LOMONTE et al., 1987, LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003; MOURA-DA-SILVA et al., 1991; MELO; OWNBY, 1999; TRENTO et al., 2001).

Estruturalmente são constituídas por 125 resíduos de aminoácidos, unidos por seis pontes dissulfídricas e contêm uma extensão C-terminal com cinco a sete resíduos. Dentre estas fosfolipases são reconhecidos três tipos diferentes; a) as clássicas com ácido aspártico no carbono 49, que catalisa a hidrólise do éster ligado à posição sn-2 do glicerofosfolipidio (Asp49); b) as variantes, também denominadas proteínas semelhantes a PLA2 (PLA2 símile) por serem estruturalmente semelhantes,

mas destituídas de atividade enzimática, contendo lisina em substituição ao ácido aspártico, (Lys49), (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003); c) variantes com serina ocupando a posição 49, (Ser49), (KRIZAJ et al., 1991; POLGÁR et al., 1996), as duas últimas enzimaticamente inativas (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003). Lee et al. (2001) propõem que as características estruturais destas impedem a liberação do ácido graxo produzido após a hidrólise inicial do fosfolipídio, interrompendo o ciclo catalítico. Seu efeito mionecrótico transcorre por uma via catalítica independente da atividade enzimática, sendo acompanhado, in vivo, por edema, hiperalgesia, liberação de citocínas proinflamatórias como interleucina 6 (IL 6), além de atividade letal quando injetada por via endovenosa ou intraperitonial em camundongos (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003).

In vitro as fosfolipases A2 apresentam efeitos na placa neuromuscular

principalmente aquelas Lys49 de vários venenos, mas também a Asp49 no veneno da Bothrops insularis (COGO et al., 1998), atividade citolítica que se expressa pela ruptura de lipossomos compostos de fosfolipídios carregados negativamente (SOARES et al., 2000b), promoção da degranulação de mastócitos com conseqüente aumento da permeabilidade vascular e formação de edema

(LANDUCCI, et al., 1998), além de provocarem lesão renal em sistema de rim isolado de rato (BARBOSA et al., 2002).

Recentemente Barbosa et al. (2005) comprovaram atividade bactericida em miotoxinas fosfolipase A2, Asp49 e Lys49, do veneno da Bothrops jararacussu. A

Asp49 demonstrou atividade enzimática e destruiu a membrana e a parede celular do microorganismo Xanthomonas axonopodis, induzindo desorganização e perda de elementos citoplasmáticos, quando examinados por microscopia eletrônica.

A despeito de inúmeras pesquisas, as bases moleculares para a seletividade e especificidade farmacológica das PLA2, não estão ainda claras. Basicamente o seu

alvo primário está localizado no exterior da célula, e seu mecanismo de ação parece envolver três mecanismos. Em primeiro lugar sua atividade catalítica intrínseca que pode liberar ácidos graxos e lisofosfolipídios ativos com potente ação biológica. Em segundo lugar a ligação interfacial com as camadas lipídicas das membranas celulares, com ou sem hidrólise de fosfolipídios, podendo afetar as funções celulares ou integridade das membranas destas células. Finalmente a ligação a proteínas específicas nas superfícies celulares, que atuam como receptores ligados à membrana, já havendo sido identificados receptores específicos para fosfolipases A2

de cadeia única. Nas células neurais de ratos os do tipo N, e tipo N símile, em células pulmonares, hepáticas, cardíacas e renais. Estes receptores se ligam com elevada afinidade a PLA2 neurotóxicas. Em células musculares esqueléticas de coelhos foram observados receptores do tipo M, e do tipo M símile também em células pulmonares, hepáticas, cardíacas e renais. Estes últimos ligando-se principalmente a PLA2 não tóxicas (VALENTIN; LAMBEAU, 2000).

São receptores pertencentes à superfamília das lectinas do tipo C, que guardam pouca identidade nos resíduos de aminoácidos mas mantém uma região extracelular N-terminal rica em cisteína que se assemelha ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) da fibronectina. Esta região, CRD, é zona de ligação da fosfolipase A2 ao receptor, que se liga também à região de ligação ao

cálcio, e com isto tem inibida sua atividade catalítica mas tem atividade endocitária e internaliza a fosfolipase (VALENTIN; LAMBEAU, 2000). A fosfolipase A2 fracionada

do veneno da Bothrops insularis, tem sua atividade tóxica essencialmente dependente de sua ação enzimática. Inicialmente produz contração muscular que se segue a uma inibição da transmissão neuromuscular. Este último efeito parece

resultar de alterações na cinética dos canais de potássio pré e pós sinápticos (COGO et al., 1998).

Independentemente de possuírem ou não atividade enzimática, as fosfolipases A2 desestabilizam os fosfolipídios das membranas celulares e induzem

lesão da membrana celular e induzem lesão da membrana celular, permitindo um influxo descontrolado de íons cálcio e sódio que promovem alterações intracelulares irreversíveis culminantes com a morte celular (LOMONTE; ÂNGULO; CALDERÓN, 2003).