Funn fra intervju - Akseptkriterier Respondent 1

Uma importante característica a ser observada num processo fermentativo envolvendo xilose é o transporte deste açúcar para o interior da célula que ocorre por meio de proteínas de membrana, os transportadores. Em S. cerevisiae, foram identificados 20 genes envolvidos com o transporte de açúcar (HXT1-17 e GAL2) e os sensores de hexoses codificados por SNF3 e RGT2 (Boles & Hollenberg, 1997). Os transportadores codificados pelos genes HXT8-18 possuem um nível de expressão muito baixo, já HXT1-7 e GAL2, que também possuem afinidade por glicose, apresentam expressão alta em determinadas condições de concentração de glicose. HXT1-7 e GAL2 foram caracterizados como transportadores de difusão facilitada, sendo HXT1 e HXT3 de baixa afinidade, HXT2 e HXT4 de afinidade moderada, e HXT6, HXT7 e GAL2 de alta afinidade (Maier et al., 2002). Entretanto,

todos têm um alto KM para xilose (~190 mM), ou seja, uma baixa afinidade por este

açúcar (Hector et al., 2008). A afinidade por xilose chega a ser até 200 vezes menor que por glicose (Kötter & Ciriacy, 1993).

Em S. cerevisiae, o transporte de xilose e arabinose na presença de glicose é mais rápido em condições anaeróbicas (Jeffries, 1983). Estudos mostram que os transportadores de alta e moderada afinidade Hxt4, Hxt5, Hxt7 e Gal2 são os mais importantes no transporte de xilose (Hamacher et al., 2002). Quando uma linhagem de S. cerevisiae recombinante para fermentação de xilose foi cultivada em xilose sob condições aeróbicas ou limitantes de oxigênio, foi observada uma indução da expressão dos transportadores de alta afinidade, os de baixa afinidade tiveram um aumento de 2-5%. Isso sugere que se utilize em S. cerevisiae transportadores de alta afinidade para o transporte de xilose (Jeffries & Jin, 2004). Outros transportadores já foram expressos em S. cerevisiae: Xlt1 de Trichoderma reesei promoveu o crescimento em xilose (Saloheimo et al., 2007), At5g59250 e At5g17010 de Arabidopsis thaliana melhorou o influxo de xilose (Hector et al., 2008), Sut1 de P. stipitis (Katahira et al., 2008) e Gxf1 de Candida intermedia (Runquist et al., 2009), melhoraram o influxo de xilose e o rendimento de etanol. Além disso, verificou-se a importância da interação do transportador heterólogo com as proteínas de membrana (transportadores e sensores) da própria S. cerevisiae (para revisão ver Young et al., 2010)

Em P. stipitis, o transporte de xilose e glicose ocorre pelo sistema de “próton simporte”, envolvendo tanto transportadores de alta quanto de baixa afinidade por xilose. O sistema “próton simporte” pode representar uma desvantagem para a eficiente e completa fermentação de xilose devida à restrição energética. Estudos demonstraram que, em condições de anaerobiose e limitação de O2, a assimilação

da xilose é menor, mas isso provavelmente ocorre não por uma regulação dos transportadores por O2, mas por comprometimento nas primeiras etapas da via

metabólica de xilose que requer O2 para a produção dos cofatores (Hahn-Hägerdal

et al., 1994; Weber et al., 2010). Outro ponto importante, é que os transportadores de baixa afinidade são responsáveis pelo influxo de glicose e xilose, entretanto, há uma inibição não-competitiva da glicose por estes transportadores, impedindo a entrada de xilose (Kilian & van Uden, 1988).

Foram caracterizados três genes que codificam transportadores de açúcar em P. stipitis: SUT1, SUT2 e SUT3. O primeiro é induzido por glicose, independentemente da oxigenação. Os outros dois são expressos em condições aeróbicas, independentemente da fonte de carbono. Entretanto, todos têm uma afinidade maior por glicose do que por xilose (Weierstall et al., 1999). Após a conclusão do sequenciamento do genoma de P. stipitis, foram identificadas, por meio de análises computacionais, mais de 15 ORFs com homologia significativa com genes transportadores de açúcar. Dentre as 15 ORFs analisadas, 7 são similares a genes que codificam transportadores putativos de xilose em outras leveduras e receberam, pois, a denominação “XUT” (Xylose Uptake Transporter) (Jeffries et al., 2007) (Figura 52).

Figura 52: Árvore filogenética. Análise filogenética dos 7 transportadores XUT de P. stipitis

(Ps) e de outros putativos transportadores de xilose das leveduras Debaryomyces hansenii (Dh) e Candida intermedia (Ci)

No interior da célula, o nível de expressão de cada gene é diferente, e varia de acordo com as necessidades metabólicas. Portanto, a expressão varia conforme a condição em que a célula se encontra. Os substratos, sua concentração, e as condições ambientais em que a célula se encontra são sinais para ativar ou reprimir a expressão dos genes. Existem diferentes técnicas que permitem analisar o nível de expressão gênica em um organismo. Dentre elas podemos citar: Microarranjo de DNA, Northern blot, PCR semi-quantitativo, e o Real Time qRT-PCR (Real Time quantitative Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction).

O Real Time qRT-PCR é baseada na técnica de PCR e permite quantificar, em tempo real, o produto formado a cada ciclo de amplificação. Determina os níveis

de RNA mensageiro ou de RNAs não-codantes com maior precisão e acurácia. Essencialmente, essa técnica é realizada em três etapas: (i) Obtenção da fita de cDNA por meio de transcrição reversa do RNA. (ii) Amplificação do cDNA por PCR. (iii) Detecção e quantificação em tempo real do produto formado (Nolan, 2006).

Neste trabalho, foi avaliada a expressão diferencial de alguns genes da via metabólica de xilose na linhagem adaptada de P. stipitis CBS5774 em diferentes fontes de carbono sob aeração. Este estudo teve o intuito de lançar luzes sobre as alterações de padrões de expressão gênica que ocorrem na levedura em diferentes condições de cultivo. Em particular, buscamos focar na expressão dos genes dos transportadores de xilose (putativos e experimentalmente confirmados). Este estudo teve como meta principal escolher um transportador alternativo para ser expresso na linhagem recombinante de S. cerevisiae, VCB112, desenvolvida neste trabalho, para melhorar o crescimento e, consequentemente, a produção de etanol em meio contendo xilose. Apesar da sua maior afinidade por glicose, o transportador HXT7 de S. cerevisiae é o mais eficiente no transporte de xilose (Sedlak & Ho, 2004). Portanto, este foi o primeiro transportador de escolha para ser expresso na levedura recombinante VCB112.

5.3.3 Análise da expressão diferencial de P. stipitis