5 Policy instruments for promoting
5.3. Funding agencies Enova
3.1 – Objectivos
Após produção das linhas Z/EG-Dll4, iniciou-se a análise da função do gene Dll4 com o cruzamento com a linha pCAGGS-Cre, produzindo assim uma sobre-expressão ubíqua de Dll4. Pretendia-se avaliar o funcionamento do transgene Z/EG-Dll4 nas linhas Z/EG-
Dll4(CD1) e Z/EG-Dll4(FVB), e seleccionar apenas uma linha para os estudos subsequentes.
A análise do fenótipo resultante deste cruzamento poderia também ajudar a revelar a importância de Dll4 para o desenvolvimento embrionário, em geral, e vascular, em particular. A análise do fenótipo de sobre-expressão ubíqua de Dll4 funciona, em primeira instância, como um ponto de comparação em relação ao objectivo principal da produção desta linha, a análise do fenótipo de sobre-expressão de Dll4 específica ao endotélio. A confirmação dos fenótipos obtidos ao restringir a área de sobre-expressão, especificamente aos tecidos afectados, permitiria avaliar se os defeitos seriam autónomos ou não autónomos, conforme descrito no capítulo 4.
3.2 – Materiais e métodos
3.2.1 - Material de origem animal:
- Embriões de ratinho: Analisaram-se embriões resultantes de diversos cruzamentos. Foram analisados embriões resultantes de vários cruzamentos:
Cruzamento de fêmeas de ratinho (Mus musculus) da estirpe CD1 (Harlan Ibérica) com machos da linha Z/EG-Dll4 (quimeras e heterozigóticos). CD1 é uma estirpe não consaguínea.
Cruzamento de fêmeas de ratinho da linha CAGGS-Cre (Araki, 1996; (Niwa,
et al., 1991), (fundo genético CD1) com machos da linha Z/EG-Dll4. A linha
CAGGS-Cre foi gentilmente cedida pelo Doutor Tristan Rodriguez do Laboratório de Desenvolvimento de Mamíferos, NIMR, Londres. Estes expressam a recombinase Cre sob o controlo do conjunto enhancer de citomegalovirus/promotor de β-actina de galinha (Araki, 1996)(Niwa, et al.,
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1991). Tal conduz a uma expressão forte, ubíqua e constitutiva da recombinase
cre.
Os ratinhos foram hospedados no biotério da Faculdade de Medicina Veterinária, em sistema sem barreiras. Toda a manipulação foi efectuada de acordo com a legislação Portuguesa, Portaria nº 1005/92.
3.2.2 - Estabelecimento de cruzamentos entre ratinhos
Para obtenção de embriões colocaram-se machos reprodutores de uma linha, com mais de cinco semanas, em gaiolas com fêmeas da linha pretendida, do mesmo tamanho ou menores, ao fim da tarde. Em geral, cada macho foi colocado em conjunto com duas a três fêmeas. Na manhã seguinte foram seleccionadas as fêmeas com rolhão vaginal e isoladas. O rolhão vaginal é produzido pelas secreções das glândulas vesiculares e coagulantes do macho, podendo apresentar-se como uma estrutura sólida de cor amarela ou branca na superfície da vagina ou numa posição mais profunda. Para a determinação do estádio de desenvolvimento considera-se que a fertilização ocorre cerca da meia-noite, num ciclo de escuridão entre as 17.00h e as 07.00. Ao meio-dia do dia seguinte, isto é, do dia em que se avalia a presença do rolhão vaginal, os embriões são datados como tendo 0,5 dias “post-coitum” (0,5 dpc). Ao meio-dia do dia seguinte os embriões terão 1,5dpc e assim sucessivamente. As idades pré- determinadas são confirmadas por contagem de número de sómitos (Kaufman, 1992).
3.2.2.1 - Colheita e dissecção de embriões
As fêmeas gestantes e isoladas foram sacrificadas por deslocação cervical ao fim da manhã no dia em que os embriões se encontravam no estádio a estudar, ou à hora correspondente à porção do dia correspondente ao estádio que era objectivo dissecar. Humedece-se o abdómen com etanol a 70% (v/v) e efectua-se uma incisão transversal no abdómen. Em seguida procede-se à extracção do útero para uma placa com PBS. Aí procede- se à individualização dos embriões, que estão cada um dentro da sua respectiva cripta uterina, e depois à remoção da camada muscular envolvente do útero, do tecido decidual, da placenta (ou cone ectoplacentário, no caso de embriões com 8,5 dpc), do saco vitelínico, do cordão umbilical e do saco amniótico.
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3.2.3 - Extracção de ADN para genotipagem de ratinhos
Os animais nascidos permaneceram com as progenitoras até altura do desmame, que ocorreu entre as 3 e as 4 semanas. Nesse momento retirou-se a extremidade da cauda dos ratinhos e estes foram marcados com furos nas orelhas, correspondentes a um número específico.
Para obter ADN das biópsias de cauda, estas são colocadas em 750µl de solução de lise de caudas (0,1M Tris-HCl, 5mM EDTA, 0,2% SDS, 200mM NaCl) com 20µl de proteinase K (20mg/ml) e incubadas a 55ºC durante a noite.
No dia seguinte adiciona-se 250µl de 5M NaCl e vortexa-se durante cinco segundos. Centrifugam-se os tubos durante dez minutos a 13000 rpm, numa microcentrífuga de bancada, e recolhe-se 850µl do sobrenadante para novos tubos. Em seguida adiciona-se 750µl de isopropanol e agita-se para misturar as soluções. Centrifugam-se os tubos durante dez minutos a 13000 rpm, numa microcentrífuga de bancada, para precipitar o ADN, e remove-se o sobrenadante. Lava-se o precipitado com 500µl de 70% etanol e centrifuga-se durante cinco minutos a 13000 rpm, numa microcentrífuga de bancada. Remove-se o sobrenadante e deixa- se secar os tubos ao ar. Ressuspende-se o ADN em 250µl de TE.
3.2.3.1 - Genotipificação por PCR
As reacções de PCR foram realizadas criando misturas de reacção com 5pmol de cada oligonucleótido iniciador, 5pmol de dNTPs (Sigma DNTP100A), 2U de Taq GE Healthcare 27-0799-61), 1µl de ADN genómico ressuspendido em TE, tampão comercial diluído à sua concentração nativa e água até perfazer 20µl.
Cada conjunto de misturas de reacção que partilham os mesmo oligonucleótidos iniciadores é colocado num termociclador e seguem um programa de temperaturas específico. As sequências de oligonucleótidos e programas de termociclador estão descritos no Anexo II.
O resultado, o produto da amplificação de uma sequência de ADN específica, é observado em electroforese de gel de agarose (ver 2.2.3).
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3.2.4 - Fixação e inclusão de tecidos e embriões em gelatina
Após a recolha de tecidos ou embriões, estes precisam de ser fixados. A fixação é o processo químico que previne a degradação de tecidos biológicos para armazenamento estável e análise. A fixação bloqueia as reacções bioquímicas celulares em curso, em particular enzimas proteolíticas que de outra forma degradariam a amostra, aumentando a rigidez estrutural e a estabilidade dos tecidos e dos diferentes constituintes celulares nas suas posições originais. Os fixadores mais comuns são os da classe de fixadores de ligações cruzadas, como o formaldeído. Estes funcionam por criarem ligações covalentes, pontes de metileno, entre proteínas. Os fixadores desta classe preservam a estrutura secundária das proteínas e grande parte da estrutura terciária também, sendo esta a razão pela qual é benéfico fazer uma fixação curta quando o objectivo é a utilização do tecido para detecção de proteínas por anticorpos. Neste trabalho usou-se sempre uma variante do formaldeído, o paraformaldeído. A grande vantagem do paraformaldeído face ao formaldeído é que forma uma matriz celular menos fechada, promovendo a fixação eficiente das proteínas e a retenção dos ácidos nucleicos, mas permitindo ao mesmo tempo que anticorpos e sondas relativamente grandes consigam entrar nessa matriz celular , tornando possível a sua detecção. O paraformaldeído tem ainda a vantagem de ter autofluorescência baixa, ao contrário de outros membros desta classe de fixadores, como o glutaraldeído (Lawrence ; Singer, 1985).
O paraformaldeído apresenta-se na forma de um pó branco, sendo uma molécula polimérica grande, insolúvel à temperatura ambiente. É necessário despolimerizar o paraformaldeído para que este entre em solução, para isso é necessário hidrolisar o polímero. Para isso é preciso água, tampão fosfato como fonte de iões hidróxido, que actuam como catalisadores da reacção, e calor, cerca de 60ºC.
O tempo de fixação varia consoante o objectivo para o qual as amostras vão ser usadas. No caso do objectivo ser o uso para imunohistoquímica ou imunofluorescência, a fixação é feita colocando o material biológico numa solução de 4% de paraformaldeído (Sigma P6148) em PBS, a 4ºC, durante uma a duas horas, com agitação. No caso do objectivo ser o uso para hibridação in situ, a fixação é feita colocando o material biológico numa solução de 4% de paraformaldeído em PBS, a 4ºC, durante a noite ou durante cerca de 16 horas, com agitação.
Os tecidos fixados podem ser analisados de duas formas, in toto ou seccionados. In
toto corresponde a uma análise ao tecido, ou embrião, inteiro, em que se observam
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características morfológicas internas e externas na perspectiva de uma lâmina transversal muito fina. Quando a estrutura a analisar é complexa, que ocorre na maioria dos casos, é vantajoso analisar secções do tecido face à análise in toto.
Quando os tecidos são processados para análise in toto, após o período de fixação fazem-se duas lavagens em PBS, a 4ºC, para remover o fixador em excesso, e de seguida os tecidos são desidratados numa série de soluções, com concentração crescente de metanol diluído em PBS, a 4ºC, até se encontrarem em metanol puro. Nesse momento os tecidos podem ser armazenados a -20ºC, até um ano.
Quando os tecidos são processados para análise por secções, estes são incluídos em matriz de gelatina. Esta matriz serve como suporte estrutural ao tecido durante a congelação e facilita o processo de corte, ao criar uma superfície geométrica. Após a fixação, os tecidos são lavados em PBS, a 4ºC, para remover o excesso de fixador e de seguida são desidratados numa solução com 4% de sacarose (Sigma S0389) em PBS até o tecido perder flutuabilidade. Em seguida os tecidos são colocados numa solução com 15% de sacarose em PBS até o tecido perder flutuabilidade. Depois o tecido é colocado numa solução com 15% de sacarose e 7,5% de gelatina (Sigma G2500) em PBS a 37ºC, para que a solução se mantenha no estado líquido, durante uma a duas horas consoante se tratem de embriões ou tecidos adultos. Após este tempo colocam-se os tecidos numa placa com uma base de solução de 15% de sacarose e 7,5% de gelatina em PBS solidificada, cobertos por uma gota de solução de gelatina, e deixa- se solidificar. Em seguida cobrem-se as gotas que contêm os tecidos com solução de 15% de sacarose e 7,5% de gelatina em PBS e deixa-se solidificar, durante cerca de 45 minutos. Após este tempo cortam-se paralelepípedos de gelatina contendo uma amostra isolada, com a orientação pretendida. Pretende-se que estes blocos de gelatina ultrapassem a superfície da amostra apenas o necessário para que se consiga manipular as secções sem tocar na amostra, quando se estiver na fase de corte. Quanto maiores forem os blocos mais difícil será conseguir uma congelação uniforme, eficiente e rápida do interior do bloco, e por isso do tecido. Os blocos são então colados a um quadrado de cartão que serve ao mesmo tempo como identificador do bloco e como face de orientação do bloco, que após a fase de congelação passa a ser opaco. Em seguida os blocos são congelados ao serem imersos em isopentano (Merck 1.06056.1000) arrefecido a -80ºC com azoto líquido, durante 20 segundo a um minuto, conforme o tamanho do bloco. Os blocos congelados são armazenados a -80ºC até serem cortados em crióstato.
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3.2.5 - Criosecções
As amostras incluídas em matriz de gelatina congeladas foram crioseccionadas num crióstato Leica CM3050S, a -29ºC. A espessura de secção foi 12µm, excepto onde notado. As lâminas onde se recolheram as criosecções têm de secar durante uma hora à temperatura ambiente antes de serem guardadas a -20ºC em caixa de armazenamento com sílica.
3.2.6 – Produção de sondas de ARN
3.2.6.1 - Preparação de ADN molde para transcrição in vitro
As sondas de ARN complementar usadas em técnicas de hibridação in situ, são produzidas por transcrição in vitro de ADNc clonados em vectores de expressão. Normalmente esses vectores de expressão têm um local múltiplo de clonagem flanqueado por dois promotores virais, normalmente os promotores de bacteriófago T3, T7 ou SP6, em sentidos opostos.
Para cada plasmídeo, selecciona-se uma enzima de restrição que corte o vector, mas não o ADNc, no lado oposto ao promotor viral a usar para transcrever a sonda de ARN complementar. A execução desta restrição é essencial para que a sonda produzida contenha apenas a sequência de interesse ou muito pouco do vector em que foi clonada.
Após a restrição do plasmídeo, o ADN é extraído com fenol/clorofórmio e em seguida precipitado com acetato de sódio e etanol absoluto e lavado com 70% etanol. O ADN é então ressuspendido em água bidestilada, livre de ARNases.
3.2.6.2 - Transcrição in vitro
Uma reacção típica de transcrição in vitro contém 400ng de ADN linearizado, 20U de inibidor de ribonucleases (Promega N2111), 200nmol de DTT (Sigma D9760), 10nmol de dNTPs (Roche 11 277 073 910), 25U de polimerase de ARN T3 (Roche 11 031 163 001), T7 (Roche 10 881 767 001) ou SP6 (Roche 10 810 274 001), tampão comercial específico diluído à sua concentração nativa, e água bidestilada livre de ARNases. Esta mistura é colocada a 37ºC durante duas horas. Após este tempo adiciona-se 5 µl de uma solução com 10% SDS (Merck 1.13760.0100) e incuba-se a amostra a 80ºC durante cinco minutos. Em
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seguida adiciona-se 1/3 do volume final em 8M NiCl (Sigma N5756) e duas vezes e meia em etanol absoluto, e coloca-se a amostra a -80ºC durante uma hora. Em seguida a amostra e centrifugada a 13000rpm durante 30 minutos numa microcentrífuga de bancada, a 4ºC. Após a centrifugação descarta-se o sobrenadante e lava-se o precipitado com 70% etanol, centrifugando a 13000rpm durante cinco minutos. Em seguida remove-se o sobrenadante e deixa-se o precipitado secar ao ar durante 20 minutos, protegido de contaminações. Após este tempo ressuspende-se o ARNc em 10mM EDTA (Sigma E5134) pH8 e armazena-se a -20ºC.
Tabela 21 – Descrição da origem e conteúdo dos plasmídeos usados para produzir sondas de ARNc para hibridação in situ.
3.2.7 - Hibridação in situ
A técnica de hibridação in situ é uma forma de hibridação, um processo de combinação de duas cadeias complementares de ácidos nucleicos em cadeia simples numa única molécula de cadeia dupla. Esta técnica usa uma molécula de ARN complementar marcada, uma sonda, para detectar a localização de moléculas de ARN mensageiro num tecido. As sondas usadas são moléculas de ARN marcadas com uracilos acoplados a digoxigenina, um esteróide apenas presente naturalmente como um metabolito secundário em plantas do género Digitalis. Por isso, os anticorpos anti-digoxigenina não apresentam ruído quando usados em tecidos com outras origens (Chevalier, et al., 1997). Por ser uma molécula muito pequena, os nucleótidos acoplados a esta molécula não apresentam problemas ao serem
Sonda para o gene
Plasmídio com o ADNc gentilmente cedido por:
Fragmento clonado Enzima de restrição e polimerização
dll1 Dr Domingos Henrique 0,7Kb do ADNc, inclui o domínio DSL e as 2 primeiras repetições do domínio EGF
EcoRV Polimerase de ARN T3
dll4 Dr. Domingos Henrique ADNc inteiro EcoRV
Polimerase de ARN T3 notch1 Dr. Domingos Henrique 1,4kb do ADNc, inclui o domínio NLR e parte dos
motivos cdc10
EcoRI Polimerase de ARN SP6 notch4 Dra. Janet Rossant 1Kb do ADNc, inclui 9 repetições do domínio EGF Polimerase de ARN T3 SmaI
ephrin-B2 Dra. Janet Rossant 700pb XbaI
Polimerase de ARN T7 ephb4 Dra. Janet Rossant 1kb do ADNc, inclui o domínio de cinase de
tirosinas
SalI Polimerase de ARN T7
hey1 Dr. Deepak Srivastava ADNc inteiro EcoRV
Polimerase de ARN SP6
hey2 Dr. Deepak Srivastava ADNc inteiro EcoRV
Polimerase de ARN SP6
cx37 Dra. Janet Rossant 978pb SpeI
Polimerase de ARN T7
alk1 Dra. Janet Rossant 1,9Kb SalI
Polimerase de ARN T7
endoglin Dra. Janet Rossant 1,1Kb HindIII
Polimerase de ARN T7 vegfr2 Dr. Domingos Henrique 800pb do ADNc, inclui o domínio transmembranar e parte do domínio extracelular Polimerase de ARN SP6 XbaI
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integrados na fase de transcrição in vitro. O sistema de hibridação in situ com nucleótidos acoplados a digoxigenina é muito sensível e permite que não se recorra a tecnologias de hibridação in situ radioactivas. Esta técnica tem por objectivo observar o padrão de expressão de um determinado gene.
3.2.7.1 - Hibridação in situ de criosecções
As lâminas com as criosecções são retiradas do congelador a -20ºC e colocadas à temperatura ambiente, protegidas do pó, a descongelar durante uma hora. Ao fim de 50 minutos retira-se a solução de hibridação do congelador a -20ºC e separa-se em alíquotas para cada sonda a usar. Adiciona-se a sonda de ARN respectiva a cada alíquota (diluída de 75 a 200 vezes consoante a alíquota de sonda, tem de ser testado para cada alíquota de sonda nova), vortexa-se e colocam-se as alíquotas a 80ºC para desnaturar as sondas. Adiciona-se 100 a 120µl de solução de hibridação com sonda a cada lâmina e cobre-se com uma lamela. A hibridação ocorre a 62-65ºC, durante a noite, em caixa selada com o fundo coberto por papel 3MM (Whatman) humedecido com uma solução de 1x sais/50% formamida (formamida - Sigma F7503), pré-aquecida.
Após a fase de hibridação efectuam-se as lavagens da sonda não hibridada. As lavagens são feitas com 1xSSC pH7/50% formamida, em frascos Coplin de vidro, pré aquecida a 65ºC. Efectuam-se três lavagens, a primeira de 15 minutos, onde se deve garantir que as lamelas caem, e as duas seguintes de 30 minutos cada. Em seguida as lâminas são lavadas com TBST, à temperatura ambiente, duas vezes 15 minutos.
O bloqueio de ligações inespecíficas é feito colocando a solução de TBST + 2%BBR + 20% de soro de ovelha inactivado (BBR – Roche 11 096 176 001/ Soro de ovelha – Sigma S3772) sobre as lâminas, sem lamela, em câmara húmida. A fase de bloqueio dura duas horas. Após esta fase adiciona-se o anticorpo anti-digoxigenina acoplado a fosfatase alcalina (Roche 11 093 274 910), diluído 1:2000 em solução de incubação, TBST + 2%BBR + 1% de soro de ovelha inactivado, às lâminas (100µl em cada) e cobrem-se com lamelas. As lâminas são colocadas em câmara húmida e ficam a 4ºC durante a noite.
Após a fase de incubação com o anticorpo anti-DIG as lâminas são colocadas em frascos Coplin com TBST, à temperatura ambiente, para lavagem do anticorpo em excesso. São efectuadas cinco lavagens consecutivas, durando uma hora cada. A lamela deve cair na primeira lavagem. Em seguida as lâminas são lavadas duas vezes em NTMT, durante 15 minutos cada. As lâminas são reveladas colocando 120 µl de BMpurple (Roche 11 442 074
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001) nas lâminas e cobrindo-as com lamela. As lâminas são então colocadas em câmara húmida a 32ºC, no escuro, até se observar marcação. Em seguida as lâminas são lavadas duas vezes em PBS + 0,1% Tween20 (PBSW), durante dez minutos cada e depois lavadas com água destilada, para remover restos de sais de fosfato. Para preservação a longo termo as lâminas são montadas com Aquatex, um meio de montagem aquoso. Todas as soluções estão descritas no Anexo I.
3.2.8 - Imunohistoquímica e imunofluorescência de criosecções
Estas duas técnicas baseiam-se no uso de anticorpos específicos para uma determinada proteína, para detectar a localização dessa proteína num tecido.
As lâminas com as criosecções são retiradas do congelador a -20ºC e colocadas à temperatura ambiente, protegidas do pó, a descongelar durante uma hora. Colocam-se as lâminas num frasco Coplin com PBS, em banho-maria a 37ºC, durante 15 minutos, para remover a gelatina das criosecções. Em seguida as lâminas são lavadas duas vezes com PBS, durante cinco minutos cada. Após esse tempo as lâminas são colocadas em 3% H2O2 (Merck
1.07298.0250) em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente para inibir a acção das peroxídases endógenas, reduzindo assim o ruído de fundo na fase de revelação. Este passo só é efectuado no caso de se o protocolo ser relativo a imunohistoquímica com anticorpos secundários acoplados a HRP (peroxídase de rábano) (BD Pharmingen 554017). Depois as lâminas são lavadas duas vezes com PBS +0,1% Tween-20 (PBSW), durante dez minutos cada e em seguida são colocadas a bloquear em 2% albumina de soro bovino (Sigma A3311) e 5% de soro inactivado da espécie em que é produzido o anticorpo secundário a usar, em PBS. As lâminas ficam em câmara húmida, sem lamela, durante uma hora à temperatura ambiente. Após este tempo escorre-se a solução de bloqueio das lâminas e adiciona-se o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio, sendo que o valor de diluição é específico para cada anticorpo [anti-PECAM1 (Parmingen #557355) – 1:200; anti-SMA (Sigma A5228) – 1:100; anti-fibronectina (Sigma F3648) – 1:50; anti-laminina (Sigma L9393) – 1:50]. Cobrem-se as lâminas com lamelas e colocam-se as lâminas em câmara húmida a 4ºC durante a noite.
No dia seguinte as lâminas são lavadas cinco vezes em PBSW, durante dez minutos cada, sendo que na primeira lavagem as lamelas têm de cair. Em seguida adiciona-se o anticorpo secundário específico para a espécie em que o anticorpo primário correspondente foi produzido, diluído em solução de bloqueio, sendo que o valor de diluição é específico para
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cada anticorpo [anti-rat IgG conjugada com HRP (Pharmingen #554017) – 1:100; anticorpos secundários fluorescentes (Molecular Probes, Invitrogen) – 1:400]. Cobrem-se as lâminas com lamelas e colocam-se as lâminas em câmara húmida à temperatura ambiente durante uma