Fullkommen konkurranse

Todos os cães apresentavam sinais compatíveis com a LV no M0, sendo os mais observados as dermatopatias e linfadenomegalia, seguidos de onicogrifose, lesões oftálmicas e caquexia. Esses resultados, corroboram parcialmente com os de Freitas et al. (2012), que observaram mais frequentemente caquexia, ceratoconjuntivite, linfadenomegalia, além de outros. Segundo Salzo (2008), as dermatopatias estão presentes na maioria dos casos, concordando com os nossos resultados.

O tratamento da LVC tem como objetivos a redução da carga parasitária e a melhora do estado geral do animal (OLIVA et al., 2010), sendo estes os principais parâmetros no acompanhamento da terapia (FERRER et al., 1988; REIS et al., 2006). Os protocolos instituídos neste estudo (G1 e G2) mostraram-se eficientes em promover a melhora clínica dos cães com LVC, sem que se observasse diferença entre a melhora clínica proporcionada e o tratamento empregado. Além da melhora clínica, nos momentos subsequentes ao tratamento, todas as amostras foram negativas, mesmo aquelas que apresentaram intenso parasitismo em M0, sendo inclusive significativa entre os momentos 3 e 6 em relação ao M0. Xavier et al. (2006) e Alves (2008) também observaram existir uma relação entre a redução da carga parasitária, determinada pela imuno-histoquímica, na pele e o estado clínico do animal. Estes achados revelam a eficácia dos protocolos de tratamento utilizados nesse estudo, concordando com diversos pesquisadores (BANETH; SHAW, 2002; SANTOS et al., 2007; GÓMEZ-OCHOA et al., 2009; OLIVA et al., 2010).

Por meio da técnica de imuno-histoquímica, foi possível quantificar a carga parasitária, mostrando ser uma excelente ferramenta de diagnóstico e avaliação do tratamento. Apresenta alta reprodutibilidade associado ao baixo custo, tendo em vista que no caso foi empregado como anticorpo primário soro hiperimune de cão com LVC, seguindo o preconizado por Tafuri et al. (2004). Esses pesquisadores padronizaram a técnica e ainda sugerem sua aplicação em biopsia de pele visando aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico e por ser uma boa ferramenta para avaliar a evolução da doença e a resposta ao tratamento.

A presença de Leishmania (L.) infantum chagasi disseminada na pele é um dos principais motivos que tornam os cães importantes no ciclo epidemiológico da doença, uma vez que é o sitio onde o vetor Lutzomiya longipalpis adquire a infecção (QUEIROZ et al., 2010). A importância da pele na LVC se deve também por ser um órgão que pode ser o indicador clínico da doença e onde acontece a primeira interação do parasito com o sistema imunológico (QUEIROZ et al., 2011).

No presente estudo, oito dos 11 cães com LV, aproximadamente 73% (8/11), apresentaram formas amastigotas na pele no momento 0, que se tornaram negativas após 3 e 6 meses de tratamento. Quanto aos 3 cães com resultado negativo nas reações imuno-histoquimicas, embora com sinais clínicos evidentes, além da positividade dos exames de triagem empregados, suscita algumas considerações. Uma delas poderia ser devido ao reduzido tamanho da amostra de pele, coincidentemente não apresentando parasitas ou seus antígenos. Além deste, deve-se considerar as respostas imunes individuais, regulando a permanência dos parasitas na pele (SILVA, 2007).

Apesar de os animais apresentarem-se negativos na pele após o tratamento, e possivelmente gerando dificuldades na transmissão para o vetor, a completa cura parasitológica é considerada rara, e o parasita consegue se alojar e se multiplicar em outros órgãos. Recidivas são esperadas, principalmente em situações de doenças concomitantes, estresse, imunossupressão, interrupção do tratamento, entre outras (RIBEIRO; MICHALICK, 2001; PARADIES et al., 2012; ARTACHO, 2009; CALADO, 2010). Nos estudos de Calado (2010), foi observada reduzida expressão da gp-P e MRP1 na pele e no baço de cães LV e alta expressão desses anticorpos nos rins, adrenais e fígado, o que poderia explicar a evidente melhora clínica e rara cura parasitológica.

Nosso estudo acompanhou os animais por 3 e 6 meses, todavia seria necessário monitorá-los por um tempo maior e avaliar se ocorreriam recidivas clínicas, ou retorno da positividade na pele. Mormente, estes animais ainda estão sob tratamento e permanecem com a doença controlada.

Todos os cães expressaram gp-P na pele no momento M0, confirmando a reatividade do clone C494 em tecidos de cães (GINN, 1996; CALADO, 2010; GERARDI et al., 2014). O padrão de marcação exibido pela gp-P na pele de cães

com LV antes e após o início do tratamento foi, principalmente, de moderada a forte em membrana das células secretoras das glândulas sudoríparas e do endotélio vascular, assim como de moderada a fraca, porém infrequente, em fibroblastos e macrófagos. Ginn (1996) foi o primeiro pesquisador que detectou a expressão da gp- P na pele de cães saudáveis, e a localização se restringiu aos ductos das glândulas sudoríparas e não uniforme na epiderme. Anos mais tarde Calado (2010) avaliou a expressão da gp-P na pele de cães com LV e detectou a expressão na epiderme, glândulas sudoríparas e sebáceas. Nossos resultados foram parcialmente congruentes aos apresentados por esses autores, que podem ser explicados pelas diferenças nos protocolos imuno-histoquímicos, como tempo de fixação das amostras no formol, que não foi citado pelo autor, assim como a metodologia aplicada na recuperação antigênica, sendo a nossa realizada pelo calor enquanto a realizada por Ginn (1996), enzimática.

Poucos são os trabalhos que avaliaram a expressão da gp-P pela técnica de imuno-histoquímica na pele de cão. A maioria das pesquisas existentes sobre a sua expressão são direcionadas a tumores (BERGMAN, 2003; HONSCHA et al., 2009; GASPAR et al., 2010; GERARDI et al., 2014)

Interessante observar que não infrequentes são as descrições da expressão da gp-P em glândulas sudoríparas nas distintas espécies, como em cães (GINN, 1996; CALADO, 2010), camundongos silvestres (ITO et al., 2008), humanos saudáveis, além de vasos sanguíneos (SKAZIK et al., 2011). Segundo esses autores, a localização da gp-P nos vasos pode influenciar na absorção dos fármacos e sua localização nas glândulas sudoríparas suporta o seu papel na eliminação de xenobióticos através dos ductos de suor.

A expressão da gp-P permaneceu em progressão em 50% dos cães tratados com a vacina inativada e Alopurinol e em aproximadamente 29% dos cães tratados com a vacina inativada, Alopurinol e Domperidona. No entanto, A6 e A7 apresentaram diferenças significativas na expressão em relação às demais amostras, ou seja, foram as amostras que tiveram maiores expressões nos dois momentos. Pode-se sugerir que esses animais, por apresentarem elevada expressão inicial, ao se administrar os fármacos a biodisponibilidade na pele poderia ser reduzida em comparação àqueles animais que tinham baixa expressão, embora

o número de amostras nessa condição seja muito pequena. Todavia, segundo Ito et al. (2008), que pesquisaram a gp-P na pele de camundongos, após administrarem itraconazol por via intravenosa, detectaram que os camundongos knockout (mdr1a/1b-/-) tinham maior concentração do fármaco na pele do que os camundongos selvagens, sugerindo que a bomba de efluxo desencadeada pela MDR funciona como uma barreira para entrada de xenobióticos da corrente sanguínea para a pele.

A marcação pela MRP1, clone ABCC1, obteve marcação que variou de fraca a intensa em glândulas sudoríparas, endotélio vascular e fibroblastos de cães com LV, apesar de ser espécie-específico para humanos,. Esse é o primeiro estudo a utilizar o clone ABCC1 na pele de cães por imuno-histoquímica, com padronização da técnica. A expressão imuno-histoquímica da MRP1 já foi conseguida em tecidos caninos, utilizando o clone anti-MRP1 de origem humana (CALADO, 2010; GERARDI et al., 2014) e por outras técnicas, como PCR (CONRAD et al., 2001). Especificamente na pele de cães, somente Calado (2010) avaliou a expressão, contudo, não especificou o local de marcação, apenas que foi citoplasmática, como no atual estudo. Semelhante a gp-P, os trabalhos com tecidos de cães são, a maioria, direcionados para área da oncologia (MEALEY et al., 2003; CULMSEE et al., 2004, GERARDI et al., 2014).

Não obstante, quanto aos locais de marcação, recentemente Osman-Ponchet et al. (2014) assinalou, em pele de humanos, a expressão acentuada de MRP1 dentro do folículo piloso, glândulas sudoríparas e células musculares, assim como expressão moderada na epiderme basal. A não marcação do folículo piloso e células musculares em nosso experimento podem ser justificadas pelas diferenças de procedimentos laboratoriais ou mesmo devido ao anticorpo não ser específico para cães.

No estudo em tela, a expressão da MRP1 mostrou progressão em 50% das amostras no G1 e 57% no G2. Aparentemente, na maior parte dos cães tratados houve aumento da expressão da MRP1 na pele. Entretanto, a melhora clinica foi uniforme entre os cães após o tratamento, independente do tratamento, e não houve diferença estatística entre as amostras com relação a MRP1. Da mesma forma que pesquisas realizadas com a gp-P por outros autores, Li et al. (2005) avaliaram a

presença e função da MRP1 na pele após administrarem, via intravenosa, o fármaco grepafloxacina em camundongos silvestres e knockout (FVB/MRP1-/-_{), sendo que}

estes últimos apresentaram maior concentração do fármaco na pele, sugerindo que o fármaco pode ser transportado pela MRP1 da pele de volta a corrente sanguínea.

Um dos efeitos adversos dos fármacos, além da toxicidade, é a falta de eficácia, que ocorre principalmente quando uma droga não atinge concentrações terapêuticas adequadas no tecido alvo. Isto pode ser um fator importante para resistência do parasita ao tratamento, pois essas concentrações nos tecidos são altamente dependentes da atividade dos transportadores ABC (MEALEY, 2013).

As dificuldades em estabelecer a cura parasitológica e evitar as recidivas (PARADIES et al., 2012; RIBEIRO et al. 2013) podem ser facilmente explicadas pelo aparecimento de cepas resistentes, como detectado recentemente por Maia et al. (2013). Esses pesquisadores investigaram a susceptibilidade aos fármacos em diferentes cepas de Leishmania infantum de pacientes humanos e caninos, com e sem tratamento e concluíram que formas parasitárias amastigotas e promastigotas isolados de cães que estavam sob tratamento com alopurinol tiveram maior concentração inibitória para o fármaco, em comparação, inclusive, aos isolados de cães que não estavam sob tratamento, comprovando que houve o desenvolvimento de parasita resistente em cães.

Como o aparecimento de resistência e a falta de eficácia dos fármacos podem ser devido à elevada expressão da gp-P e MRP1, o que não permite que o fármaco atinja sua concentração ideal nos tecidos caninos, apresentamos com essa pesquisa outro olhar sobre os transportadores do tipo ABC na LVC, mormente sejam necessárias muitas mais pesquisas que abordem o fenômeno de resistência a múltiplas drogas, um expressivo numero de cães tratados e de protocolos de tratamento em cães com essa grave zoonose. Na medicina veterinária, a utilização da gp-P e MRP1 como marcadores de prognóstico parecem ser muito úteis, mais enfaticamente na medicina oncológica individualizada (HONSCHA et al., 2009).

Melhorar o entendimento sobre o papel de gp-P e da MRP1 na pele de cães sob tratamento para leishmaniose visceral pode ser de grande importância para o desenvolvimento de uma terapêutica mais eficaz, que inclua cura parasitológica do

animal, que evite o aparecimento de cepas resistentes, e que, principalmente, evite a eutanásia como forma de controle da LVC.

Devido ao agravamento da situação zoonótica da LV no Brasil e a falta de consenso sobre a melhor política de saúde para o controle da doença (COSTA, 2011), espera-se que esse estudo contribua com subsídios para as autoridades em saúde pública. Especificamente, que mostre a preocupação e a responsabilidade de veterinários em buscarem meios e métodos para tratar a LVC de forma mais eficiente e segura, tanto para os animais, quanto para a saúde humana.