Fritt vilt (2006)

Para a determinação da genotoxicidade três testes foram realizados utilizando-se o mesmo lote de sangue periférico coletado de cada indivíduo após tratamento com diferentes concentrações e via de exposição ao extrato de floração de Microcystis spp.

No primeiro experimento, dez peixes foram colocados em um aquário de vidro (40L) contendo uma alíquota do extrato (concentração de aproximadamente 200µg/30ml) totalizando uma concentração de 5 µg/L de microcistina, e um grupo controle, com dez animais, foram expostos apenas à água dos tanques. Este grupo foi utilizado como controle para os outros experimentos, visto que os animais foram tratados da mesma maneira e vieram do mesmo lote e do mesmo local. O segundo

experimento seguiu a mesma metodologia do primeiro, porém com concentração maior (103,725 µg/L de microcistina).

Para verificar se há alteração na genotoxicidade por outra via de exposição da microcistina, no terceiro e quarto experimentos o extrato foi introduzido nos animais via injeção intra-peritonial com doses de 1,0 ml (total de 138µg/100g de peso corpóreo de microcistina) e 0,5 ml (69µg/100g de peso corpóreo de microcistina), respectivamente. Foram usados oito animais por grupo de tratamento, em aquários de 40L com tempo de exposição de 72 horas cada um.

Para se determinar a significância dos resultados obtidos nos métodos de avaliação da genotoxicidade, utilizou-se o método Mann-Whitney´s U-teste (α=0,05).

3.3.1 Teste de micronúcleo:

O teste de micronúcleo é um teste citogenético e revela as conseqüências de anomalias no fuso e quebras cromossomais e vem sendo aplicado em peixes (Oost et al, 2003).

O teste do micronúcleo em peixes é similar ao teste em mamíferos e foi adaptado para as características do organismo-teste baseado em protocolos descritos em outros experimentos realizados com peixes. O sangue periférico foi coletado com seringas heparinizadas em duas espécies diferentes Oreochromis niloticuse Astianax bimaculatus.

As lâminas de esfregaço foram feitas com, aproximadamente, uma gota de sangue (50 μL) de cada espécime e, por 24 horas, secaram em temperatura ambiente. Após secagem, foram fixadas em metanol por 15 minutos e coradas com laranja de acridina para serem analisadas em microscópio óptico de fluorescência (Axioskop 2 – Zeiss), na objetiva de 100x, onde foram contadas 3.000 células por animal.

O corante laranja de acridina identifica claramente o micronúcleo (Figura 8) e também distingue eritrócitos com RNA (imaturo) e eritrócitos não fluorescentes (maduro). Baseado no conhecimento que se tem sobre a cinética de formação de micronúcleos, efeitos agudos de substâncias tóxicas podem ser mais sensivelmente detectados em eritrócitos imaturos do que em maduros. Já para efeitos crônicos não é necessário distinguir os eritrócitos.

Segundo Fenech (2000) existe uma classificação a ser considerada para a realização da análise do micronúcleo. Desta maneira, o critério utilizado para identificar os eritrócitos micronucleados foi o seguinte:

1. O micronúcleo deve ser um terço menor que o núcleo principal; 2. Um micronúcleo não deve tocar no núcleo principal e;

3. Um micronúcleo não deve refringir, deve ter a mesma coloração e intensidade do núcleo principal.

As médias de micronúcleos obtidas em cada espécie foram comparadas entre si e analisadas estatisticamente pelo método não paramétrico Mann-Whitney’s U- test (α=0,05).

Figura 8– Eritrócitos de sangue periférico de carpa (C. carpio) corados com laranja de acridina. Seta: eritrócito micronucleado (Hayashi et al, 1998).

3.3.2 Teste do Cometa:

O teste foi realizado segundo a técnica descrita por Singh et al. (1988), com algumas modificações para adaptar a técnica para peixes.

A coleta de sangue periférico foi feita com seringas e agulhas heparinizadas e após a retirada do sangue, 2 gotas ou 100 μL de sangue, aproximadamente, de cada peixe são transferidos para um ependorf contendo 500μL de soro bovino. Logo depois se tratou o sangue para que fosse feita uma eletroforese para se calcular os danos no DNA.

1. lâminas de 26 x 76 mm serão imersas em um recipiente contendo agarose tipo II diluída em tampão PBS (NaCl 1,5 M; Na2HPO40,1M; NaN3 0,02%, pH 7,2) a

1,5% e depois serão mantidas à temperatura ambiente, pelo período de 12 horas para secagem da agarose.

2. 120 μL de Low melting point agarose (LMP) a 0,5%, diluída em tampão PBS e aquecida a 37°C em banho-maria, serão rapidamente misturados a 10 μL da amostra de sangue (50μL) diluído em um ependorf contendo 500 μL de soro HAM – F10. Imediatamente após este procedimento, 120 μL dessa mistura irão ser gotejados em uma lâmina preparada de acordo com o item anterior. Uma lamínula vai ser acoplada e o conjunto levado à geladeira. A partir dessa etapa, as lâminas devem ficar sempre protegidas da luz, a fim de prevenir novas quebras no DNA;

3. após 5 minutos na geladeira, a lamínula irá ser removida e as lâminas mergulhadas em um Koplin coberto com papel alumínio, contendo solução de lise final gelada (2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1X de Triton X-100);

4. depois de pelo menos uma hora no tampão de lise a 4°C, as lâminas vão ser colocadas em uma cuba de eletroforese contendo tampão de eletroforese (300 mM NaOH, 1mM EDTA) fresco, pH 13. Após 30 minutos em repouso, proceder-se-á a eletroforese a 25 V e 300 mA por um período de 30 minutos;

5. após a eletroforese, lavar as lâminas com solução neutralizadora (0,4M Tris, pH 7,5). Esse processo se repetirá por três vezes em intervalos de 5 minutos;

6. o material neutralizado irá ser fixado em etanol 100% por 5 minutos e em seguida, deixado para secar em temperatura ambiente.

7. a coloração dos núcleos vai ser feita gotejando-se sobre as lâminas 30 μL de solução aquosa de Brometo de Etídio.

Efetuou-se a contagem de 100 células por animal em teste cego com microscópio óptico de fluorescência Axioskop-II Carl Zeiss, filtro de 510-560 nm, barreira de filtro de 590 nm e aumento total de 400x .

Desta maneira, foi feita a caracterização do tamanho e integridade da cauda do cometa que representa os níveis de lesões no DNA, de acordo com o critério descrito por Singh et al., 1988, que ocorrem nos eritrócitos do sangue periférico coletado das espécies utilizadas no estudo. Deste modo, classificaram-se as células em estágios de 0 a 4 conforme figura 9.

Figura 9- Classificação dos níveis de fragmentação do DNA segundo o grau de lesão.

Após a classificação dos níveis de fragmentação do DNA utilizou-se uma fórmula para quantificar o dano no DNA. Tal fórmula é dada por:

ID (ua) = N1 + 2.N2 + 3.N3 + 4.N4 S/100

Onde,

ID = índice de danos no DNA; ua = unidade arbitrária;

N1 – N4 = nucleóides nas classes 1 a 4 e

S = número de nucleóides analisados, incluindo os de classe 0.

Os índices de dano obtidos em cada espécie foram comparadas entre si e analisadas estatisticamente pelo método não paramétrico Mann-Whitney U- test (α=0,05).

3.3.3 Teste Necrose/Apoptose:

Após o período de exposição, com introdução do extrato de floração de Microcystis spp via intra-peritonial, coletou-se sangue periférico com seringas heparinizadas, o qual foi transferido para um microtubo de 2 ml com soro fetal bovino a temperatura de 23ºC. Uma alíquota de 15l de suspensão celular foi transferida para uma lâmina e corada com 1l de Laranja de Acridina e Brometo de Etídio (1:1). Após a coloração cobriu-se com uma lamínula para a identificação de células viáveis (coloração verde), em apoptose e em necrose (coloração vermelha).

0

1

2

3

A contagem foi realizada em microscópio óptico de fluorescência Axioskop 2 Zeiss com objetiva de 100x, onde foram contabilizadas, quando possível, 500 células por animal. Para verificar a significância dos resultados, utilizou-se o teste t (p<0,05) comparando-se o controle negativo com os tratamentos realizados.