Os núcleos da cadeia principal da proteína ClpS foram assinalados através da coleta e análise dos experimentos 3D de tripla ressonância HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH e HNCO. Os espectros foram adquiridos de acordo com os métodos descritos em 3.3.3.3 usando uma amostra da proteína ClpS duplamente marcada com 13C e 15N.
Conforme descrito anteriormente, os experimentos 3D de tripla ressonância usam acoplamentos escalares de uma ou duas ligações para correlacionar as freqüências de ressonância de até três núcleos diferentes. A magnetização inicia-se no núcleo do hidrogênio amídico e é transferida sucessivamente através das ligações covalentes para outros núcleos fornecendo informações sobre os núcleos de hidrogênio, nitrogênio (15N) e carbono (13C) da cadeia principal. A Tabela 14 resume as correlações observadas para assinalar as freqüências de ressonância dos núcleos da cadeia principal da proteína ClpS.
Tabela 14. Resumo das correlações observadas nos experimentos 3D de tripla ressonância utilizados para assinalar os núcleos da cadeia principal da proteína ClpS . i indica a posição de um resíduo de
aminoácido ao longo da cadeia polipeptídica (adaptado de CLORE e GRONENBORN, 1998). Experimento Correlação observada
HNCA 13Cα(i)-15N(i)-1HN(i)
13
Cα(i-1)-15N(i)-1HN(i)
HN(CO)CA 13Cα(i-1)-15N(i)-1HN(i)
HNCACB 13Cα(i)-15N(i)-1HN(i)
13
Cβ(i)-15N(i)-1HN(i)
CBCA(CO)NH 13Cα(i-1)-15N(i)-1HN(i)
13
Cβ(i-1)-15N(i)-1HN(i)
Inicialmente foi analisado o espectro HNCA que fornece correlações entre as ressonâncias dos núcleos de 1HN, 15N e o núcleo 13Cα de um mesmo resíduo de amino ácido (i) e com o núcleo de 13Cα do resíduo anterior (i-1). Os picos referentes às correlações intra-residuais no espectro são fortes, enquanto que aqueles referentes às correlações seqüenciais, são geralmente mais fracos, fornecendo assim um caminho para o assinalamento. Como exemplo deste procedimento, a Figura 31 mostra fatias selecionadas do espectro de HNCA de ClpS indicando o caminho percorrido no assinalamento seqüencial das ressonâncias dos resíduos 72 a 76.
Para eliminar potenciais ambigüidades, este espectro foi analisado paralelamente com o espectro HN(CO)CA, que mostra apenas as correlações seqüenciais i.e., correlaciona as ressonâncias dos núcleos de 1HN, 15N de um mesmo resíduo de amino ácido (i) com o núcleo de 13Cα do resíduo anterior (i-1). Embora os espectros de HNCA e HN(CO)CA tenham possibilitado o assinalamento de grande parte dos núcleos de 13Cα da cadeia principal da proteína ClpS, algumas ambigüidades resultantes da sobreposição de alguns picos permaneceram. Estas ambigüidades, foram resolvidas através da análise combinada dos espectros HNCACB e CBCA(CO)NH. O espectro HNCACB correlaciona as ressonâncias dos núcleos de 1HN, 15N de um mesmo resíduo de amino ácido (i) com as ressonâncias dos núcleos de 13Cα e 13Cβ do mesmo resíduo (i) e do resíduo anterior (i-1). Já o espectro CBCA(CO)NH correlaciona apenas as ressonâncias dos núcleos de 1HN,
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N de um mesmo resíduo de amino ácido (i) com o núcleos de 13Cα e 13Cβ do resíduo de amino ácido anterior (i-1). Isto é, o espectro HNCACB fornece correlações intra-residuais entre todos os núcleos 1HN, 15N, 13Cα e 13Cβ de um mesmo resíduo e correlações inter-residuais entre os mesmos núcleos, enquanto o
espectro CBCA(CO)NH nos fornece apenas correlações inter-residuais e seqüenciais entre os vários núcleos.
A Figura 32, mostra fatias selecionadas do espectro de HNCACB intercaladas com fatias selecionadas do espectro CACB(CO)NH, ilustrando dois caminhos para o assinalamento seqüencial dos resíduos 72 a 76, um baseado nos deslocamentos químicos de 13Cα e outro, nos deslocamentos químicos 13Cβ. Uma análise combinada destes espectros, associada aos resultados obtidos anteriormente através da análise dos espectros HNCA e HN(CO)CA, possibilitou a obtenção dos valores de deslocamentos químicos (δ) para cada um dos núcleos 1HN, 15N, 13Cα e 13Cβ da
cadeia principal de cada amino ácido e da correlação destes com os núcleos da cadeia principal de amino ácidos vizinhos.
Paralelamente foi também analisado o espectro HNCO que correlaciona as ressonâncias dos núcleos de 1HN, 15N de um mesmo resíduo de amino ácido (i) com a ressonância do núcleo 13CO do resíduo de amino ácido anterior (i-1), fornecendo assim valores de deslocamento químico para cada um dos núcleos de 13CO da cadeia principal da proteína.
O processo de atribuição de cada pico do espectro 2D 1H-15N HSQC a um resíduo de amino ácido específico da proteína ClpS foi realizado selecionando-se inicialmente resíduos na seqüência primaria da proteína com deslocamento químicos (δ) característicos. Por exemplo, como pode ser visto na Tabela 8 (seção
3.1.2.1), apenas as glicinas possuem um valor médio de deslocamento químico para o núcleo 13Cα em torno de 45 ppm e não apresentam valor de deslocamento químico para o núcleo 13Cβ uma vez que este núcleo inexiste neste amino ácido.
Figura 31. Fatias selecionadas do espectro de HNCA da proteína ClpS.
A linha vermelha indica o caminho percorrido para o assinalamento seqüencial das ressonâncias dos núcleos de 13Cα dos resíduos 72 a 76, baseado nas correlações existentes entre um amino ácido e o seu vizinho anterior. De um modo geral picos fortes correspondem às correlações entre o grupo amídico e o núcleo Cα do mesmo resíduo (intra-residual) enquanto picos fracos referem-se às correlações seqüenciais entre o grupo amídico de um resíduo e o núcleo Cα do resíduo anterior.
D e sl oc am e n to quím ic o 13C
Figura 32. Fatias intercaladas selecionadas dos espectros de CACB(CO)NH (Fatias A) e HNCACB (Fatias B) da proteína ClpS.
As linhas indicam o caminho percorrido para o assinalamento seqüencial das ressonâncias dos núcleos de 13Cα e 13Cβ dos resíduos 72 a 76, baseado nas correlações existentes entre um amino ácido e o seu vizinho anterior. As linhas vermelhas referem-se ao assinalamento das ressonâncias
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Cα. As linhas azuis referem-se ao assinalamento das ressonâncias 13Cβ Note-se que, conforme esperado, no caso das glicinas (G71 e G74) não se observam sinais de 13Cβ. De um modo geral, picos fortes correspondem às correlações entre o grupo amídico e os núcleos 13Cα e 13Cβ do mesmo resíduo (intra-residual) enquanto os picos fracos referem-se às correlações seqüenciais entre o grupo amídico de um resíduo e os núcleos 13Cα e 13Cβ do resíduo anterior.
D e sl o cam e n to q u ím ico 13C
Assim, picos do espectro H- N-HSQC que nos espectros de tripla ressonância apresentaram picos correspondentes com um deslocamento químico de
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Cα em torno de 45 foram atribuídos aos quatro resíduos de glicina presentes na proteína ClpS.
Outros exemplos de amino ácidos facilmente identificáveis por terem deslocamentos químicos para os núcleos de 13Cα e 13Cβ característicos são as alaninas (13Cβ ~ 20 ppm), as treoninas (13Cβ ~ 70 ppm) e as serinas (13Cβ ~ 65 ppm). Usando estes amino ácidos como pontos de referência na seqüência, e sabendo-se os δ do núcleos de 13Cα e 13Cβ do aminoácido anterior (i-1) é possível efetuar o encadeamento sucessivo dos vários amino ácidos. Este encadeamento é apenas interrompido pela presença de prolinas (que totalizam sete nesta proteína), por serem imino ácidos (i.e. o 15N da ligação peptídica faz parte de um anel imídico).
Usando a metodologia descrita acima foi possível atribuir as ressonâncias de aproximadamente 98% dos núcleos da cadeia principal da proteína ClpS. A Figura 33 mostra o espectro 2D 1H-15N-HSQC da proteína ClpS contendo 96 picos amídicos assinalados de um total de 98 picos esperados para esta proteína (106 amino ácidos, menos 1 resíduo N-terminal, menos 7 resíduos de prolina). Os resíduos amídicos não assinalados pertencem aos amino ácidos T38 e L100, e não puderam ser atribuídos pois os seus picos correspondentes não foram observados no espectro 1H-15N-HSQC. Os restantes núcleos da cadeia principal também foram atribuídos com sucesso. A Tabela 15 apresenta a estatística da atribuição dos vários núcleos da cadeia principal de ClpS. O assinalamento completo dos vários núcleos pode ser visto no Apêndice 1 que contém as informações do arquivo “ppm.out” gerado pelo programa NMRView 5.0 (JOHNSON e BLAVINS, 1994).
Figura 33. Espectro 2D 1
H-15N HSQC da proteína ClpS mostrando o assinalamento dos picos 1H-15N da cadeia principal.
As legendas acima dos picos indicam os resíduos de amino ácidos na seqüência da proteína. Os picos conectados por linhas e sem legenda são referentes a ressonâncias 1H-15N dos grupos C(=O)NH2 das cadeias laterais de de resíduos de asparagina e glutamina.
Tabela 15. Estatística da atribuição dos núcleos da cadeia principal da proteína. Núcleo % de núcleos atribuídos Resíduos não-atriuídos
HN 98 T38, L100
CO 93 M1, T5, K19, A23, P24, P25, Y37
Cα 97 M1, P24, P25
Cβ 96 M1, P24, P25, L100