6.3 Funn og diskusjon
6.3.1 Forventninger
Na matriz extracelular do coração, todos os três tipos de fibras do sistema elástico puderam ser identificados, através da microscopia eletrônica, ao lado de populações de fibrilas de colágeno de diferentes diâmetros.
Tanto no endocárdio como no epicárdio do VE, a microscopia eletrônica revelou a presença de abundantes fibras elásticas propriamente ditas e frequentes fibras elaunínicas no tecido conjuntivo sub-endotelial. As fibras oxitalânicas, isoladas, eram mais raras. Nestes dois compartimentos, não foram observadas diferenças na distribuição e na frequência das fibras do sistema elástico entre as linhagens WIS, WKY e SHR (Figuras 20 a 23). No entanto, na região mais profunda do epicárdio dos animais SHR observou-se uma maior quantidade de colágeno fibrilar, sem o aumento correspondente de fibras do sistema elástico (Figura 23).
No perímisio do miocárdio do VE dos animais da linhagem WIS e WKY, foi possível observar grande quantidade de fibras elaunínicas e oxitalânicas, sendo que as fibras elásticas propriamente ditas apareceram com menor frequência (Figuras 24 e 25). No entanto, nos animais SHR, as fibras elásticas e elaunínicas apareceram raramente, de modo que o sistema elástico no perimísio destes animais era representado principalmente pelas fibras oxitalânicas, como mostram as Figuras 26 e 27. Nos animais SHR e, em menor escala, nos WKY apareceram quantidades abundantes de fibras colagênicas, o que contribui para o aumento da resistência tecidual.
No endomísio do VE de ratos WIS e, em menor frequência nos WKY, a matriz extracelular apresentou-se rica em fibras elásticas e elaunínicas ao lado de fibras finas de colágeno, formadas por poucas fibrilas finas (Figuras 28 e 29 e 30). Também é possível observar fibras oxitalânicas delgadas no endomísio de ratos WIS e WKY.
No miocárdio de animais SHR o endomísio se mostrou espessado e apresentou maior densidade de fibrilas de colágenas grossas quando comparado às duas outras linhagens; com relação às fibras do sistema elástico, no endomísio do VE de ratos SHR não foram encontradas fibras elásticas propriamente ditas, os perfis de fibras elaunínicas eram raros e havia grande quantidade de fibras oxitalânicas (Figura 31 e 32).
Estes achados, consistentemente observados em todos os corações estudados, estão resumidos na Tabela 6.
Tabela 6. Distribuição diferencial das fibras do sistema elástico no ventrículo
esquerdo de ratos Wistar (WIS), Wistar-Kyooto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR).
Endocárdio e Epicárdio
Miocárdio
Perimísio Endomísio
WIS e WKY SHR WIS e WKY SHR WIS e WKY SHR
Fibras oxitalânicas
-
-
++
+++
++
++
Fibras elaunínicas++
++
+++
+
++
+
Fibras elásticas+++
+++
++
+
++
-
Um aspecto ultra-estrural comum a todas regiões de endomísio analisadas nas três linhagens foi a grande interação entre a matriz extracelular e a membrana dos cardiomiócitos e dos fibroblastos em toda sua extensão ou em estruturas especializadas de adesão célula-matriz, como as placas de adesão e os costâmeros dos cardiomiócitos. Estes achados são uma tradução morfológica dos fenômenos de transdução do sinal mecânico da matriz extracelular aos elementos do citoesqueleto e podem ser observados nas Figuras 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34 e 35.
Figura 20 - Micrografia eletrônica do endocárdio de rato Wistar. A célula endotelial (seta rosa) reveste a cavidade ventricular e se apóia em um tecido conjuntivo rico em fibras elásticas (setas vermelhas) facilmente identificáveis pela presença de elastina (que se mostra muito eletrondensa devido ao acréscimo de ácido tânico no fixador). Observar ainda fibrilas de colágeno (C) formando fibras finas. Logo abaixo do endocárdio encontra-se um cardiomiócito (CM) tipicamente rico em mitocôndrias e filamentos contráteis organizados em sarcômeros. Este mesmo padrão estrutural foi observado no endocárdio do rato Wistar-Kyoto.
Barra de aumento = 2µm.
Figura 21 - Micrografia eletrônica do endocárdio de rato SHR. Observa-se o núcleo (N) e o delgado citoplasma da célula endotelial (seta rosa) que recobre o tecido conjuntivo subjacente, onde estão presentes fibras de colágeno (C) e fibras elásticas (setas vermelhas). Sob a célula endotelial observa-se uma espessa lâmina basal (LB). Notar a delaminação da lâmina basal (barra azul); este fenômeno apareceu em várias localizações do endocárdio dos animais SHR.
Figura 22 - Micrografia eletrônica do epicárdio de rato Wistar- Kyoto. Observa-se a célula mesotelial (Mes) recobrindo um tecido conjuntivo rico em fibrilas de colágeno (C) e por fibras elaunínicas (setas), constituídas por grumos de elastina espalhados por entre os feixes de microfibrilas. Este mesmo padrão ultra-estrutural foi observado no epicárdio dos ratos Wistar.
CM = cardiomiócito. Barra de aumento = 1µm.
Figura 23 – Micrografia eletrônica do epicárdio de rato SHR. Observa-se a célula mesotelial (Mes) revestindo o tecido conjuntivo subjacente. De maneira semelhante à micrografia anterior, a seta aponta uma fibra elaunínica. Chama a atenção a grande quantidade de fibrilas de colágeno (C) que se associam paralelamente formando uma fibra colágena grossa na região mais interna do epicárdio, que pode ser interpretada como a imagem ultra-estrutural da fibrose ventricular que acompanha a hipertensão.
Figura 24 - Micrografia eletrônica do perimísio de rato Wistar. Trata-se de um tecido conjuntivo rico em fibras colágenas (C) e em fibras do sistema elástico (setas vermelhas). A maioria delas são fibras elauninícas, constituídas por grumos de elastina em meio aos feixes de microfibrilas. Notar os prolongamentos de fibroblastos (setas azuis). O mesmo padrão ultra-estrutural pode ser observado no pericárdio dos animais Wistar-Kyoto.
Barra de aumento = 1µm.
Figura 25 - Micrografia eletrônica do perimísio de rato Wistar. A imagem mostra à esquerda parte de um fibroblasto (F) e à direita parte de um cardiomiócito (CM). Na matriz extracelular podem-se perceber as fibrilas de colágeno (C) agrupadas formando fibras de disposição aparentemente espiralada. Nota-se a presença de fibras oxitalânicas como feixes de microfibrilas do sistema elástico (setas vermelhas) desprovidos de elastina. Observar que a membrana do cardiomiócito apresenta áreas diferenciadas denominadas “placas de adesão focal” (setas azuis) que são estruturas especializadas para interação da célula com a matriz extracelular. Este arranjo das fibras da matriz extracelular confere menor elasticidade do que aquele mostrado na Figura 24. Assim sendo, no perimísio de animais Wistar e Wistar- Kyoto coexistem áreas de maior e de menor conteúdo elástico. Barra de aumento = 0,5 µm.
Figura 26 - Micrografia eletrônica do perimísio de rato SHR. Na matriz extracelular, podem ser observados alguns perfis de finas fibras elásticas e elaunínicas (setas) entre as fibras colágenas (C), porém em menor concentração quando se compara com o perimísio dos ratos Wistar, como mostrado na Figura 24.
CM = cardiomiócito; F = prolongamentos de fibroblastos. Barra de aumento = 2µm.
Figura 27 - Micrografia eletrônica do perimísio de rato SHR. No centro da imagem observa-se o prolongamento de um fibroblasto (F). A região delimitada em vermelho corresponde a uma grossa fibra oxitalânica. A presença de fibras colágenas (C) e oxitalânicas confere maior capacidade de resistência a forças mecânicas. Observar a interação dos elementos da matriz com a membrana celular (setas azuis).
Figura 28 - Micrografia eletrônica do endomísio de rato Wistar. No estreito espaço entre dois cardiomiócitos (CM), estão presentes vários perfis de finas fibras elásticas propriamente ditas (setas vermelhas), identificados pela massa eletrondensa de elastina rodeada por microfibrilas. Observar também algumas fibrilas delgadas de colágeno esparsas (setas azuis) na matriz extracelular. Este tipo de constituição e arranjo dos elementos fibrilares da matriz confere grande capacidade elástica ao endomísio. Notar a intensa interação dos elementos da matriz com a lâmina basal (asteriscos) dos cardiomiócitos.
Barra de aumento = 0,5µm.
Figura 29 - Micrografia eletrônica do endomísio de rato Wistar. Nota-se os elementos fibrilares da matriz extracelular: um perfil de uma fibra elástica (seta vermelha) com grande quantidade de elastina e fibrilas finas de colágeno (setas azuis). Os elementos da matriz extracelular interagem extensamente com a lâmina basal (asteriscos) dos cardiomiócitos (CM).
Figura 30 - Micrografia eletrônica do endomísio de rato Wistar-Kyoto. Embora esta não seja uma imagem frequente, é possível encontrar nestes animais algumas regiões do endomísio semelhantes ao rato Wistar, ou seja, fibrilas de colágeno finas e esparsas (seta azul) ao lado de fibras ricas em elastina (seta vermelha) rodeadas por microfibrilas. Observar a intensa interação destes elementos entre si e com a lâmina basal (asterisco) do cardiomiócito (CM). Através desta interação molecular, os sinais mecânicos gerados no interstício são transmitidos à célula e vice-versa.
Barra de aumento = 0,2 µm.
Figura 31 – Micrografia eletrônica do endomísio de rato SHR. Notar a grande quantidade de fibrilas de colágeno (C) densamente empacotadas (que aqui aparecem, na sua maioria, cortadas transversalmente). Na periferia imediata do cardiomiócito (CM) encontra-se uma grande quantidade de microfibrilas na delimitada em vermelho. A seta azul aponta para o único ponto onde pode ser identificada a elastina. Assim sendo, nestes animais hipertensos, o endomísio dos animais SHR apresenta menor elasticidade (pela escassez de elastina) e menor complacência (pelo acúmulo de colágeno).
Figura 32 – Micrografia eletrônica do endomísio de rato SHR. Notar que as fibrilas de colágeno (C) e as microfibrilas das fibras oxitalânicas (setas vermelhas) se inserem na lâmina basal (asterisco) do cardiomiócito (CM). Nesta imagem a lâmina basal aparece mais espessa, devido à incidência oblíqua do corte, o que facilita a sua observação.
Barra de aumento = 0,5µm.
Figura 33 – Micrografia eletrônica do endomísio de rato SHR. Notar que as microfibrilas das fibras oxitalânicas (setas vermelhas) interagem diretamente com a membrana celular de um fibroblasto (F) e que os filamentos do citoesqueleto formam feixes que se direcionam à face citoplasmática da membrana celular (seta amarela). Desta forma, as informações sobre as forças mecânicas que atuam localmente são percebidas pelo citoesqueleto desencadeando cascatas de sinalização que controlam a expressão gênica do fibroblasto.
Figura 34 -. Micrografia eletrônica do endomísio de rato Wistar, mostrando estruturas especializadas de junção célula-matriz ao nível da linha Z (setas amarelas). Devido ao aspecto ondulado que confere a superfície celular, estas regiões recebem a denominação de costâmeros. Assim como as placas de adesão focal, os costâmeros estão envolvidos nos fenômenos de transdução de sinais mecânicos entre a matriz e a célula, através da conexão física entre os elementos da matriz e a cardiomiócito (seta azul).
CM = cardiomiócito; C = fibrilas de colágeno; End = célula endotelial de um capilar no endomísio; Barra = 0,5 µm.
Figura 35 - Micrografia eletrônica do endomísio de rato SHR. Notar as placas de adesão focal (setas azuis) na membrana plasmática do cardiomiócito (CM). Os filamentos do citoesqueleto (setas amarelas) do cardiomiócito se inserem na face citoplasmática da placa de adesão focal, enquanto que as estruturas da matriz extracelular se inserem na face externa. Os estímulos mecânicos são transmitidos pela densa rede de fibrilas colágenas (C) que, no animal SHR, substituiu a trama elástica e delicada que tipicamente ocupa o endomísio ventricular dos ratos normotensos.
6 DISCUSSÃO
O estudo ultraestrutural do coração normal já foi revisto recentemente, porém a matriz extracelular foi analisada em microscopia de varredura e força atômica (Goldstein e Schroeter, 2002); porém com estas técnicas é difícil distinguir os componentes fibrilares entre si. Não havia na literatura estudos sistematizados, sob a luz dos conhecimentos atuais, sobre as alteraçãoes das fibras do sistema elástico na vigência da hipertensão. O presente trabalho, através da microscopia eletrônica, demonstrou de que uma das consequências da hipertrofia cardíaca é a diminuição da concentração de fibras do sistema elástico no miocárdio, particularmente no endomísio.
Nos animais SHR, como esperado, houve uma maior pressão arterial tanto sistólica como diastólica e média. Em humanos, os dados de Framinghan Heart Study mostram a associação entre a massa do ventrículo esquerdo (analisada pelo ecocardiograma) e a média da pressão arterial sistólica e diastólica (Pimente, 2008). A hipertrofia pode ser explicada como resposta adaptativa que reduz o estresse da parede do ventrículo esquerdo como modo de manter a fração de ejeção em níveis adequados (Dougherty et al., 1984).
Na hipertensão, inicialmente, há uma fase de hipertrofia ventricular associada a um acúmulo progressivo de fibras colagênicas no ventrículo esquerdo. Este fenômeno de fibrose progressiva inicia-se mesmo na ausência de morte celular, sendo uma resposta adaptativa que preserva a
capacidade de geração de força contrátil. Mais tarde, se o estímulo pressórico persiste, surge a fibrose reparativa em resposta à morte celular. Porém, com ou sem perda celular, a fibrose leva ao enrijecimento tecidual, com menor complacência e geometria ventricular alterada (Weber, 1989; Rossi, 1998; Chancey et al., 2002). Finalmente, este processo acaba por prejudicar a função sistólica e diastólica, resultando em hipertrofia acompanhada de insuficiência cardíaca.
Nos ratos SHR utilizados neste estudo, a hipertrofia do ventrículo se estabeleceu como desejado, pois nestes, em comparação com os animais Wistar, encontraram-se significativamente maiores o volume do ventrículo esquerdo (25,5%), o volume absoluto de colágeno (389%) e a fração de volume de colágeno (263%). Que seja do nosso conhecimento, este é primeiro estudo que utiliza métodos estereológicos para avaliar as variações de volume nas linhagens Wistar-Kyoto e SHR.
Os dados eletrocardiográficos mostram que a disfunção sistólica aparece aos 2 meses de idade, nos animais SHR e a disfunção diastólica surge aos 3 meses (Kokubo et at., 2005). Estes autores relatam ainda que os animais SHR apresentam inicialmente uma hipertrofia excêntrica (aumento do índice de hipertrofia simultâneo a um valor normal da espessura relativa da parede) e, a partir das 6 semanas de idade, se instala uma hipertrofia concêntrica (índice de hipertrofia elevado associado a espessura relativa de parede também elevada). Os dados da literatura mostram que a fração de ejeção dos animais SHR é semelhante ao do rato Wistar (na idade estudada) e que a disfunção sistólica nos animais SHR é
identificada pelo menor valor do débito cardíaco e menor velocidade de encurtamento circunferencial nos SHR. A incapacidade de esvaziamento total da câmara cardíaca destes animais leva a um aumento de volume diastólico (que pode ser visto pelo aumento do diâmetro da cavidade de VE na diástole), da pressão diastólica e menor volume ejetado em cada sístole (volume sistólico); estes parâmetros em conjunto resultam em menor débito cardíaco nos animais SHR.
As alterações da capacidade volumétrica ventricular podem ser explicadas (pelo menos em parte) pela alteração na composição tecidual da parede ventricular dos animais SHR, como por exemplo, o menor contéudo de elastina e o maior volume absoluto e maior fração de volume de colágeno aqui observados, que levam a um aumento de rigidez e diminuição da complacência tecidual. A literatura científica estabelece que os parâmetros diastólicos (tempo de relaxamento isovolumétrico e a velocidade de fluxo de enchimento rápido ventricular) são menores nos animais SHR, indicando a presença da disfunção diastólica (Brilla et al., 1991) devida ao aumento da espessura da parede ventricular e à fibrose, enquanto que os achados descritos aqui de diminuição de fibras elásticas e elaunínicas no endomísio destes animais são inéditos.
Neste trabalho, os dados morfométricos principais (como massa e volume dos compartimentos de interesse) não foram calculados a partir dos valores de espessura das paredes e diâmetro ventricular obtidos pelo ecocardigrama, como, por exemplo, se calcula classicamente a massa ventricular, pela fórmula 1,047 x [(ESIV+DVE+EPVE)3-DVE3] x 0,8 + 0,6,
onde: 1,047 representa a densidade acústica do miocárdio, validada em ratos por Fard et al (2000) e os índices 0,8 e 0,6 são fatores de correção. Aqui optamos por obter valores morfométricos diretamente a partir do coração retirado do animal, no qual foi possível aplicar métodos estereológicos de cálculo do volume de cada compartimento de interesse a partir da contagem de pontos incidentes nas diferentes regiões. Certamente os valores obtidos pelos diferentes métodos não são iguais entre si e podem interferir nos resultados, como, por exemplo, no cálculo do volume absoluto de colágeno no ventrículo esquerdo, que depende certamente de uma avaliação precisa do volume deste compartimento. No entanto, as medidas diretas como fizemos aqui, são mais acuradas do que aquelas indiretas e devem ser aplicadas sempre que possível.
Uma análise crítica dos diferentes métodos para cálculo de massa e volume ventriculares faz pensar que o método que se utiliza dos dados obtidos através do ecocardiograma tem certo grau de imprecisão por ser um método não invasivo. Por sua vez, o método que se vale da dissecção e separação de cada ventrículo para posterior pesagem também implica certa imprecisão, pois as fibras cardíacas dos ventrículos são contínuas entre si e dificilmente se consegue definir exatamente o limite entre as duas paredes ventriculares. A aplicação do método estereológico usado neste trabalho pode ser considerado bastante precisa, pois em primeiro lugar faz a avaliação da fração de volume dos compartimentos e elementos de interesse (pela contagem de pontos incidentes) para, em seguida, se obter
os volumes absolutos (em cm3) pela simples multiplicação de cada fração pelo volume do compartimento de interesse.
A fibrose miocárdica tem sido definida como um aumento significante da concentração de colágeno ou de sua fração de volume acima. O aumento do volume absoluto de colágeno é um dado de fibrose menos acurado uma vez que, no caso do coração, há um da aumento de massa ventricular. Tal definição de fibrose não inclui outros fatores importantes para o desempenho tecidual como as ligações cruzadas das moléculas de colágeno e a razão entre colágeno tipo I e tipo III (ambas variáveis que tem grande impacto sobre a função tecidual). Por isso, neste trabalho, alem de se avaliar o volume de colágeno foi realizada a analise dos diâmetros das fibrilas como uma maneira de verificar a “qualidade do colágeno” que está sendo depositado.
A análise ultraestrutural da parede ventricular permitiu identificar também áreas de espessamento e reduplicação (ou delaminação) da lâmina basal subjacente ao endotélio tanto no epicárdio. O aumento de espessura e reduplicação da lâmina basal é um fenômeno comum em situações de falta de nutrientes e/ou oxigênio como ocorre nas isquemias e é a principal manifestação de microangiopatias.
No caso do diabetes, a disfunção dos pequenos vasos tem como principal manisfestação estrutural o espessamento da lâmina basal de diferentes órgãos, incluindo pele, músculo esquelético, retina, glomérulos renais. Mais ainda, este fenômeno acontece também em estruturas não vasculares, como os túbulos renais, cápsula de Bowman, nervos periféricos.
As principais características do espessamento da lâmina basal é a organização concêntrica do material em estratos concentricamente arranjados ao redor do capilar, deixando espaços irregulares entre os estratos. De modo geral, estes espaços contem debris celulares. É interessante notar que em músculo esquelético de diabéticos é possível encontrar cilindros compostos apenas de destas camadas concêntricas de lâmina basal e representam capilares cujos elementos celulares sofreram degeneração (Vraco e Benditt, 1974).
Especificamente em relação a alterações de lâmina basal de pequenos vasos cardíacos, sabe-se que a literatura descreve a existência de reduplicação de lâmina basal em capilares de corações transplantados que apresentavam também outras alterações endoteliais e degeneração de cardiomiócitos (Hammond e Yowell, 1994), em casos de miocardite eosinofílica (Rossi et al., 1996), endomiocardiofibrose (Krishnaswami et al., 1984) e Doenças de Chagas (Sanches et al, 1993). É interessante observar que em todas estas condições estudadas, há sempre alterações fibróticas associadas.
Há várias evidências que apontam para hipótese de que as alterações de lâmina basal sejam acompanhadas de atividade aumentada das metaloproteinases MMP-2 e seu inibidor TIMP (Fleschmajer et al., 2000), podendo haver também um aumento na atividade da MMP-9. Sabendo que estas moléculas são também responsáveis pelo balanço no conteúdo de elastina tecidual e podem ter contribuído para diminuir a quantidade de elastina no tecido cardíaco dos animais SHR (como foi observado em nosso
estudo) não é de surpreender que a delaminação da lâmina basal e a diminuição da elastina tecidual possam ocorrem simultaneamente.
A caracterização dos diferentes tipos de fibras do sistema elástico no coração foi realizada facilmente devido à existência de critérios morfológicos e seletivos específicos.
A matriz extracelular é composta por alguns grupos de macromoléculas incluindo diferentes tipos de colágeno, elastina, proteoglicanos e outros glicoproteínas estruturais. Em todos os vertebrados, o colágeno (em todas as suas diferentes formas) atua como fonte de resistência às forças tênseis enquanto que a elastina e os proteoglicanos