Forventede effekter av jernbanereformen

As mutações no LDLR são bastante heterogéneas por todo o mundo, exceto em algumas regiões onde se verifica a presença de um efeito fundador, como é o caso dos judeus

Askenazi descendentes da Lituânia, franco-canadianos, africanos, hebreus, finlandeses e

cristãos libaneses (Hobbs et al. 1992). Até ao momento estão descritas e publicadas na base de dados da FH (http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/;https://grenada.lumc.nl/ LOVD2/UCL-Heart/home.php) mais de 1300 mutações apesar de a grande maioria não ter sido caracterizada funcionalmente. As primeiras mutações descritas na FH fora m grandes deleções uma vez que a técnica utilizada para a pesquisa de alterações no LDLR era o Southern blotting, uma técnica que permite a deteção de moléculas de DNA, após a sua separação electroforética, por hibridação com uma sonda, cuja sequência é complementar à desse DNA. Com o surgimento de novas tecnológicas que permitiram

amplificação do DNA por reação de PCR (polymerase chain reaction) e sequenciação por Sanger, foi possível identificar mutações pontuais e pequenas deleções/inserções aumentando de forma exponencial as mutações deste tipo (Soutar and Naoumova 2007). Desta forma vários tipos de mutações foram descritos em doentes com FH, incluindo mutações que resultam da substituição de um único nucleótido levando à formação de um codão que codifica um aminoácido diferente do original (mutações missense); mutações que resultam da substituição de um nucleótido que leva a formação de um codão diferente continuando no entanto a codificar o mesmo aminoácido (mutações silenciosas); mutações que resultam da substituição de um nucleótido que leva à formação de um codão stop prematuro e consequentemente a uma proteína truncada (mutações nonsense); mutações causadas por pequenas deleções ou inserções que provocam um desfasamento na grelha de leitura originando uma proteína truncada (mutações frameshift); mutações na região do promotor e mutações que afetam o

splicing correto do pré-mRNA (mutações de splicing). A análise molecular das

mutações no LDLR levou a vários resultados importantes que permitiu um melhor conhecimento sobre a função dos diferentes domínios do recetor das LDL (Soutar and Naoumova 2007). Para alguns tipos de mutações, como é o caso dos grandes rearranjos, mutações nonsense e mutações frameshift a patogenicidade da mutação não é usualmente contestada, assumindo-se que será a causa genética da doença. Em contraste, mutações pontuais e mutações que afetam o splicing correcto do RNA são mais difíceis de aferir quanto a sua patogenicidade. A maioria das alterações detetadas no LDLR que levam a substituição de um único aminoácido tem um efeito deletério na atividade do recetor. No entanto, depois da realização de estudos funcionais foi provado que algumas destas alterações descritas como causadores de FH que não são patogénicas (Lombardi et al. 1997; Naoumova et al. 2004; Etxebarria et al. 2012; Silva

et al. 2012). Idealmente as mutações pontuais deveriam ser estudadas em células

heterólogas in vitro e a sua atividade comparada com a atividade normal do LDLR. Para uma mutação poder ser considerada patogénica tem de satisfazer os seguintes critérios: co-segregação da alteração com a hipercolesterolemia na família; ausência da alteração num grande grupo de indivíduos normolipidémicos (≥100); conservação do aminoácido afetado em várias espécies a alteração da natureza da substituição do aminoácido afetado; a natureza do aminoácido afetado e estudos funcionais (Cotton and Scriver 1998). Para as alterações que afetam o splicing existem programas que fazem a previsão

entanto falíveis, mas apenas os estudos funcionais por transciptase reversa do mRNA (RT-PCR) do indivíduos permite confirmar se a alteração é ou não patogénica. Alterações sinónimas (ocorre uma mudança de uma base, mas não há mudança de aminoácido) são usualmente consideradas como não patogénicas, no entanto foram já descritas algumas alterações sinónimas que introduzem uma nova região consenso de

splicing originando uma mutação patogénica (Bourbon et al. 2007).

Ao longo dos últimos 30 anos dois tipos de ensaios têm sido utilizados para comprovar a patogenicidade das alterações no LDLR em doentes com FH. O primeiro método, desenvolvido por Brown e Goldstein, baseia-se na determinação dos níveis de ligação,

internalização e degradação de LDL marcado radiactivamente com 125I na porção

proteica do LDL e eram inicialmente realizados em fibroblastos e linfoblastos de doentes (Goldstein and Brown 1979; Knight et al. 1987). Através deste método foi possível estudar o efeito das diferentes mutações detetadas ao longo do gene LDLR demonstrando que afetam diferentes fases do ciclo do recetor (Brown and Goldstein 1986). O segundo método foi desenvolvido mais recentemente e utiliza a citometria de fluxo para determinar a taxa de ligação e internalização de LDL marcado com 3,3’- dioctadecylindocarbocyanine (Dil), um fluoróforo lipofílicos, ou com recurso a anticorpos específicos para o LDLR, marcados secundariamente com fluorescência, de forma a avaliar os níveis de expressão do recetor à superfície (Jensen et al. 1994; Etxebarria et al. 2012). Com a utilização deste tipo de marcação é também possível analisar a expressão do recetor por microscopia de fluorescência. Vários estudos já demonstraram que este método é fiável para caracterizar mutações no recetor das LDL (Raungaard et al. 1998;Raungaard et al. 1999; Etxebarria et al. 2012). Os estudos funcionais são importantes para comprovarem se uma alteração é ou não patogénica, no entanto os estudos anteriormente foram realizados utilizando células do doente não podendo garantir que não ocorra interferência de outros fatores genéticos na modulação do efeito das alterações, para além do facto de existir interferência do alelo normal no caso de estudos realizados com células de doentes heterozigóticos. De forma a se ultrapassar este problema, desenvolveram-se sistemas heterólogos de expressão in vitro que permitem o estudo do efeito do alelo mutado na função do LDLR, sem interferência do alelo normal ou de combinações de fatores genéticos dos doentes (Hobbs et al. 1992; Silva et al. 2012).

O diagnóstico molecular de FH baseia-se na identificação de mutações em três genes que foram associados ao fenótipo de FH: LDLR, APOB e PCSK9. Mutações no gene

LDLR são a causa mais comum de FH, cerca de 60-80% dos doentes têm uma mutação

neste gene (Tosi et al. 2007). Mutações no gene APOB têm sido descritas em cerca de 2 a 10%, dependendo das populações (Humphries et al. 2008) e mutações no gene PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) são uma causa rara de FH, só cerca de 1% dos doentes com FH tem mutações neste gene (Soutar and Naoumova 2007). No entanto continua por explicar o fenótipo de cerca de 40-50% dos indivíduos co m diagnóstico clínico de FH.