Os animais tiveram sua massa aferida momentos antes do estudo eletrofisiológico e para análise histológica foram retirados os MTCs (direito e esquerdo), o coto distal (N1) e proximal (N2) do nervo fibular comum, área de NLT - segmento do n. tibial e coto distal do n. fibular comum que participavam da NLT (N3) e o n. fibular comum (N4) do MCL. Os animais foram sacrificados, imediatamente, com uma dose letal de pentobarbital sódico administrado i.p. (Fig. 5A e 5B)
B
Fig. 5 - (A) N1 – Segmento distal do n. fibular comum esquerdo – (ME).
N3 – Região da NLT – (ME).
(B) N2 - Segmento proximal do n.fibular comum esquerdo - (ME).
N4 - Segmento do n. fibular comum direito – para controle - (MCL).
N.Ciático N. Fibular comum N. tibial
4.4.1 Aferição da massa corporal e do MTC
A massa corporal e o MTC foram aferidos. O MTC direito (MLCL - músculo do lado contralateral) e o MTC esquerdo (MLE – músculo do lado experimental) foram pesados sem o tendão.
Fig.6 - Retirada do MTC.
Secção transversal do MTC comprometendo toda a sua espessura.
6
N1
N3
Esquerdo Direito N1 N2 N3 N44.4.2 Processamento histológico das fibras musculares (Análise morfológica e morfométrica)
Os músculos tibiais craniais de todos os ratos foram removidos, fixados e mantidos em nitrogênio líquido (-196 ºC) até o momento do processamento histológico. Os músculos foram submetidos a secções transversais, com espessura de 5 µ, na porção central do músculo, comprometendo toda a sua espessura (Fig. 6), utilizando o Criostato Leica CM 1850. Foram realizadas, em média, cinco cortes de um mesmo músculo, permitindo a análise de um corte com menos artefatos histológicos. As lâminas foram identificadas com o número de registro do laboratório, para que o pesquisador não soubesse, no momento da análise, a que grupo o animal pertencia. A numeração real foi revelada apenas no momento da análise estatística. Foram coradas em Hematoxilina-Eosina (HE) e os cortes histológicos foram analisados no microscópio LEICA-DMLB, com lente objetiva de 20x e aumento total de 200x. As imagens foram digitalizadas usando o software Sigma Pro Image, versão 5.0, da Jardel Scientific Corporation.
Digitalização das imagens das lâminas histológicas do MTC.
Para escolha dos cortes com menos artefatos, as lâminas histológicas foram analisadas ao microscópio óptico (MO) em menor aumento (50x). Para análise das fibras musculares foi utilizado aumento de 200x. As imagens estudadas foram salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1 GB DDR, HD 80 GB, após serem capturadas por uma câmara digital Leica DFC 280.
Fig.7 – Escolha de 5 fibras musculares por imagem. 7
Foram analisadas 50 fibras musculares, para cada membro (ME e MCL), de cada animal, usando o software Sigma Pro Image, versão 5.0, da Jardel Scientific Corporation. Para cada lâmina histológica foram digitalizadas dez imagens (dez campos distintos), e em cada um dos campos foram medidas cinco fibras musculares, totalizando 50 fibras para cada lâmina estudada. Para cada campo foram medidas fibras que apareciam por inteiro, localizadas na porção mais externa de cada quadrante e uma fibra central. Isso totalizou 2000 fibras por grupo estudado, sendo 1.000 para o MLE e 1.000 para o MLCL.
Morfometria das fibras musculares
Para a morfometria das fibras musculares (8.000), digitalizadas e salvas, foram utilizadas as seguintes medidas: área, diâmetro máximo, diâmetro mínimo e número total de fibras musculares por campo tomadas de maneira semiautomática. As medidas foram organizadas em tabelas e calculadas as médias e desvios padrões.
4.4.3 Processamento histológico dos segmentos nervosos
Os segmentos de nervo coletados, coto distal (N1) e proximal (N2) do nervo fibular comum esquerdo, local da neurorrafia (N3) e nervo fibular comum direito (N4) foram fixados em solução de Karnovisk (período superior a 24 horas), passaram por lavagem em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) por três vezes, com duração de 5 minutos cada vez e posteriormente sofreram pré-coloração com tetróxido de ósmio a 1 % por 2 horas, refrigerados a 4 ºC até o momento dos procedimentos rotineiros do processamento histológico até a coloração.
Após nova lavagem com tampão fosfato, foi realizada desidratação por uma bateria de concentrações crescentes de acetona (50 %, 70 %, 90 % e 100 %). A inclusão em resina Araldite® foi realizada em duas etapas: em solução de resina e acetona (1:1), permanecendo por 24 horas em dessecador; e em resina, após dez minutos em dessecador, permanecendo em estufa a 37 ºC por 1 hora. O emblocamento foi realizado posicionando-se o segmento de nervo em resina Araldite® e mantido em estufa a 60 ºC por 48 horas para polimerização.
Os blocos foram preparados para o corte histológico através da eliminação de excesso de resina ao redor do segmento do nervo (trimados) com auxílio de uma lupa Carl Zeiss Jema adaptada, em aumento de 1,6x e lâmina Gillette®.
Em cortes transversais, foram analisados os seguintes segmentos: segmento distal do nervo fibular comum esquerdo (N1) e segmento do nervo fibular comum direito (N4). Cortes semi-finos (0,5 µm) foram feitos em micrótomo Leica MZ6. Após o corte, a lâmina foi aquecida sobre uma chapa a 45 ºC para secagem e pré-aderência do corte à lâmina do vidro. Para a coloração foi utilizado azul de toluidina 1 % durante cinco minutos, manualmente.
Os seguintes segmentos: coto proximal do nervo fibular comum esquerdo (N2) e região da NLT (N3) foram analisados em cortes longitudinais. Após os mesmos procedimentos descritos acima até a realização dos cortes semi-finos, as lâminas foram submetidas à coloração de prata de Bielschowsky.
Digitalização das imagens das lâminas histológicas dos segmentos nervosos.
Ao MO, em aumento de 100x, foi feito a escolha do corte histológico com menos artefatos, e em aumento de 400x realizou-se a análise das fibras nervosas.
As imagens foram salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1GB DDR, HD 80 GB, previamente capturadas por uma câmera digital Leica DFC 280. As medidas foram feitas utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5 da Jande Scientific Corporation, de modo semiautomático. Foram salvas duas imagens de diferentes campos de um mesmo corte histológico.
Fig.8 – Escolha de cinco fibras nervosas por imagem.
Medidas dos segmentos nervosos
Os segmentos N1 e N4 (cortes transversais) foram submetidos à mensuração das seguintes medidas: área, diâmetro máximo, mínimo e número total das fibras nervosas por campo. As medidas foram feitas de modo semiautomático utilizando-se software Sigma pro Image Analysis, versão 5 da Jandel Scientific Corporation.
Análise de brotamento axonial lateral
Os segmentos N2 e N3 (cortes longitudinais) foram submetidos à análise das condições das fibras nervosas e do brotamento axonial lateral (crescimento dos axônios do nervo doador para dentro do nervo receptor), respectivamente.
O estudo das fibras nervosas, digitalizadas e salvas, foram organizados em tabelas e feitas às médias e desvios padrões.