Forteller og fokalisering

A grande maioria dos estudos sobre a presença de leveduras e fungos dimórficos no filoplano utilizam metodologias baseadas em: (i) observação directa das folhas ao microscópio; (ii) impressões de folhas; e/ou (iii) plaqueamento de alíquotas de suspensões resultantes da sua lavagem/maceração, com posterior isolamento em cultura pura. Também bastante referido é o método SFM (Spore-fall method – ver Cap. II), que tira partido da projecção de balistoconídios à distância por algumas leveduras. Estes estudos focaram a sua atenção, essencialmente, nos fungos filamentosos presentes no filoplano, porque são mais fáceis de detectar e identificar com base nas características morfológicas. A identificação das leveduras fica-se, geralmente, pelo género (Bullera, Sporobolomyces,

Rhodotorula ou Cryptococcus), ou resume-se a uma ou duas espécies mais representadas,

tais como Sp. roseus ou Cr. laurentii, consideradas espécies bastante heterogéneas e ubíquas. Certamente contribuíram para esta parca caracterização da população de leveduras isoladas os métodos morosos e fastidiosos que, até há relativamente pouco tempo, têm sido utilizados para identificar leveduras.

Existem nas metodologias normalmente usadas dois factores fundamentais que podem influenciar os resultados: a eficácia dos métodos de remoção física dos microrganismos do filoplano, e a adequação dos meios de cultura utilizados para o isolamento, que poderão favorecer algumas espécies e não ser apropriados para o crescimento de outras (Beech e Davenport 1971). Outros factores a ter em conta nas investigações sobre a biodiversidade

Capítulo I

dos microrganismos colonizadores do filoplano, dependendo do objectivo em vista, são a definição das amostras a obter (tipo e localização das plantas, localização das folhas na copa, idade, etc.), colheita de folhas individuais ou mistura de várias folhas, tempo decorrido entre a recolha e o processamento das amostras, conservação das amostras antes do processamento, etc. (Donegan et al. 1991).

Além dos métodos tradicionais, que envolvem o isolamento e cultura dos microrganismos, os métodos moleculares, desenvolvidos mais recentemente, têm sido cada vez mais utilizados para o estudo da ecologia das populações microbianas. Torna-se particularmente interessante o estudo sobre a diversidade das populações colonizadoras do filoplano directamente no seu ambiente, sem necessidade de recorrer ao isolamento dos microrganismos em cultura pura. Uma possibilidade é a da detecção dos microrganismos através da amplificação de fragmentos de DNA por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando primers específicos. No entanto, estas metodologias têm a desvantagem de dificilmente serem quantitativas e de permitirem apenas a detecção dos microrganismos para os quais se utilizam primers específicos, para além de outros problemas associados à amplificação por PCR a partir de amostras naturais (Wilson 1997). Para obter o DNA dos microrganismos colonizadores do filoplano, terá de se proceder à sua separação física deste substrato (por lavagem das folhas, sonicação, etc.) e subsequente extracção de DNA a partir das células separadas, ou à extracção do DNA total das folhas e dos microrganismos a partir, por exemplo, da maceração das amostras. Esta última alternativa revela-se, no entanto, muito problemática (Bramwell et al. 1995), devido, por exemplo, à presença de compostos inibitórios da reacção de PCR. A este propósito, Bramwell et al. (1995) descreveram várias metodologias aplicáveis à extracção de DNA total de microrganismos colonizadores do filoplano.

Outra possibilidade é a de utilizar primers universais, com a subsequente separação e sequenciação dos fragmentos amplificados (Yang et al. 2001). Estes autores avaliaram a composição das comunidades microbianas presentes no filoplano de diversas plantas recorrendo a técnicas independentes de cultura. Os microrganismos foram lavados das folhas por sonicação e o seu DNA total extraído. Uma pequena região pertencente ao gene do rRNA 18S, com cerca de 230 bases, foi amplificada recorrendo a primers universais, e os fragmentos de DNA obtidos foram separados por eletroforese em gel desnaturante de gradiente (DGGE). Alguns destes fragmentos foram recolhidos, purificados e sequenciados. Entre as sequências obtidas, algumas eram idênticas a outras de bactérias já conhecidas e outras correspondiam a fungos, nomeadamente A. pullulans, conhecido colonizador do filoplano. No entanto, esta técnica apresenta limitações, nomeadamente o facto de apenas se poderem separar fragmentos com menos de 400 pb, porventura insuficientes para uma

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correcta identificação dos microrganismos. Sequências muito semelhantes podem ainda formar uma banda única, para além de eventuais problemas associados à amplificação por PCR a partir das amostras naturais.

Uma outra metodologia recentemente desenvolvida, essencialmente para o estudo de comunidades bacterianas de diversos subtratos, é a hibridação in situ (FISH – Fluorescence

In Situ Hybridisation) com sondas de DNA fluorescentes (Ver Cap. V). Estas sondas podem

ser mais ou menos específicas, hibridando com o rRNA de um só microrganismo, ou grupo de microrganismos-alvo, o que permite a sua detecção, quantificação e observação da distribuição espacial directamente no substrato, através de microscopia de epifluorescência e/ou laser confocal. Existem poucos relatos da utilização deste tipo de metodologia para o estudo de microrganismos no filoplano, e ainda menos para o estudo de fungos no mesmo habitat.

Brandl et al. (2001) utilizaram a hibridação in situ para verificar a identidade de uma determinada estirpe de Erwinia herbicola, entre células de outros microrganismos presentes, directamente na superfície de folhas de feijoeiro, onde se investigava o padrão espacial de expressão de um determinado gene por esta bactéria. Verificaram que, à superfície das folhas, células próximas apresentavam níveis de expressão do gene drasticamente diferentes, supondo-se que, apesar da sua proximidade, estas células se encontravam em condições microambientais muito diferentes, de que resultavam níveis de expressão variados. Morris et al. (1997) utilizaram técnicas de microscopia de epifluorescência, entre outras, com diversos corantes, como por exemplo laranja de acridina, para observar o que chamaram de biofilmes microbianos directamente na superfície de diversas folhas (oliveira, espinafre, etc.). A utilização da hibridação in situ com sondas de DNA fluorescentes foi também utilizada para o estudo do fungo leveduriforme A. pullulans directamente em folhas (Andrews et al. 2002, Li et al. 1997, Spear et al. 1999).