Os sítios de microinjeção de Glutamato, NMDA, AMPA e L-NAME na RVLM podem ser visualizados pelas fotomicrografias representativas de cada grupo: Glutamato, Controle, AMPA e NMDA, respectivamente, na Figura 17.
32 Figura 17. Fotomicrografias de secções do bulbo de ratos Fischer. Fotomicrografia representativa do grupo glutamato (A), grupo controle (B), grupo AMPA (C), grupo NMDA (D) com seus respectivos sítios de microinjeção na RVLM.
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5 - DISCUSSÃO
A ação fisiológica do NO no SNC é amplamente investigada (Kagiyama et al., 1997), especialmente a participação do NO na modulação das respostas cardiovasculares induzidas pelo glutamato (Chen et al., 2001; Martins-Pinge et al., 2007). Neste trabalho demonstramos que o bloqueio da síntese de NO provocou atenuação da resposta pressora evocada pelo GLU. Diante deste resultado, concluímos que o NO possui efeito simpatoexcitatório sobre a via glutamatérgica na regulação das respostas cardiovasculares. Buscamos então investigar um possível mecanismo de modulação do NO sobre a função cardiovascular, para tal avaliamos o efeito do NO sobre os subtipos de receptores glutamatérgicos (NMDA e não-NMDA). Como resultado obtivemos a redução da resposta pressora ao NMDA após a microinjeção de L-NAME, enquanto a resposta pressora a estimulação causada pelo AMPA não foi atenuada pela pré-injeção de L-NAME. Estes resultados sugerem que o NO possui ação neuromodulatória prioritária sobre receptores NMDA. Desta forma, sugerimos que o NO possui ação simpatoexcitatória de modulação da função cardiovascular pela via glutamatérgica por meio dos receptores glutamatérgicos NMDA.
Em nosso estudo, microinjeções unilaterais do bloqueador da NOS, L-NAME, na RVLM não foi capaz de alterar os parâmetros cardiovasculares basais de PAM e FC (Tabela 01). É possível que os efeitos das microinjeções unilaterais sejam compensados por respostas reflexas contra lateralmente na manutenção dos parâmetros basais (Morimoto e cols., 2000). Estes autores compararam os parâmetros cardiovasculares em resposta à microinjeções bilaterais versus respostas induzidas por microinjeções unilaterais de L-NAME e azul de metileno (inibidor da guanilato ciclase solúvel) e demonstraram que microinjeções bilaterais de L-NAME e azul de metileno reduziram PA, FC e atividade nervosa simpática. Em contraste, as microinjeções unilaterais de L- NAME e azul de metileno não induziram respostas simpáticas e cardiovasculares devido ao possível efeito reflexo compensatório contra lateral (Morimoto e cols., 2000). Considerando a redução da PA, FC e da atividade simpática em resposta a microinjeção bilateral de L-NAME e ao azul de metileno estes pesquisadores demonstraram que o eixo NO-cGMP pode regular o tônus simpático e a função cardiovascular (Morimoto e cols., 2000).
34 Observamos no presente estudo que microinjeções de GLU na RVLM induziram resposta pressora, porém o pré-tratamento com L-NAME atenuou o aumento da PAM provocado pelo L-glutamato na RVLM (Fig. 09). O bloqueio da síntese de NO causado pelo L-NAME reduziu a resposta excitatória causada pela microinjeção de glutamato, sugerindo que há uma interação próxima entre NO e a via glutamatérgica no controle da pressão arterial, o que também suporta a ideia de que o NO possui ação simpatoexcitatória na RVLM. Nossos achados de que o pré-tratamento com o bloqueador da NOS diminui a resposta pressora ao GLU corroboram também aos de Chen e cols., (2001) e Martins-Pinge e cols., (2007). Martins-Pinge e colaboradores demonstraram os efeitos provocados pelo GLU na RVLM antes e após o L-NAME, em que após o bloqueio da síntese do NO a resposta observada foi a quase total abolição da resposta pressora promovida pela microinjeção unilateral de glutamato em ratos acordados (Martins-Pinge e cols., 2007). Enquanto Chen e cols., 2001 mostraram que o bloqueador da NOS causa uma atenuação dose dependente na reposta pressora induzida por GLU (Chen e cols., 2001). Mayorov e cols., (2007) encontraram uma redução da resposta simpática à estimulação glutamatérgica e a redução da resposta inicial ao estresse por jato de ar após 1 até 3 horas do tratamento bilateral com L-NAME na RVLM de coelhos acordados. Mayorov., (2005) também observou aumento da PA através da microinjeção de um doador de NO na RVLM de coelhos acordados. Em conjunto estes trabalhos demonstram a ação simpatoexcitátória do NO pela via glutamatérgica na modulação da pressão arterial pela RVLM. Entretanto, o bloqueio da síntese de NO pelo L-NAME não alterou a bradicardia reflexa induzida pela microinjeção de GLU (comparando a resposta induzida pelo GLU em relação à resposta ao GLU após pré-tratamento com L-NAME). É possível que a regulação cardíaca seja independente do efeito do NO sobre os receptores glutamatérgicos na RVLM, como descreve Mayorov (2005). Este pesquisador avaliou o efeito de L-NAME e o de bloqueadores da sGC e demonstrou que tanto microinjeções de L-NAME quanto de azul de metileno não alteram o ganho do barorreflexo sobre a FC na RVLM, sugerindo o envolvimento de outra e/ou outras regiões, que não a RVLM, na modulação das respostas sobre a FC. Observamos, no entanto, que não há diferença estatística na comparação das respostas ao PBS com as resposta produzidas pelo GLU, mas não há alteração para na comparação do grupo PBS com o GLU L-NAME. A resposta pressora ao GLU após o pré-tratamento com L-NAME é reduzida, com consequente redução da bradicardia reflexa, o que justifica a alteração dos parâmetros cardíacos quando
35 comparada a FC após GLU em relação à resposta ao PBS e a não alteração da FC no grupo GLU após pré-tratamento com L-NAME quando comparado ao PBS.
Pesquisadores mostraram que os efeitos do L-NAME na RVLM são similares aos do azul de metileno ou do ODQ (1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one, inibidor guanilato ciclase solúvel). Interessantemente a pré-injeção de L-NAME ou de azul de metileno reduziram a resposta pressora causada pela microinjeção de GLU na RVLM (Morimoto e cols., 2000). As respostas cardiovasculares causadas pela microinjeção de GLU na RVLM foram também fortemente atenuadas após microinjeção de ODQ na RVLM de ratos acordados, indicando que mecanismos ligados ao cGMP são importantes para a neurotransmissão glutamatérgica (Martins-pinge e cols., 1999). Estes dados sugerem que a via NO-cGMP pode mediar a excitação neuronal na RVLM (Morimoto e cols., 2000).
Embora diversos autores descrevam a participação do NO na RVLM como um modulador das respostas simpatoexcitatórias, as ações desta molécula no SNC são ainda bastante controversas, pois alguns trabalhos descrevem esta molécula como mediadora de respostas simpatoinibitórias sobre o sistema nervoso simpático (SNS), via liberação de GABA ou mesmo que por meio do NO há estabelecimento de modelos de hipertensão (Ishide et al., 2003; Kishi et al., 2002; Kishi et al., 2001; Patel et al., 2001). Porém, nestes trabalhos foram utilizados animais anestesiados e/ou protocolos de indução de superexpressão da NOS, a interferência causada pelo anestésico, bem como a condição não fisiológica de indução da superexpressão da NOS, podem justificar as respostas simpatoinibitórias promovidas pelo NO nestes trabalhos.
Adicionalmente, o protocolo experimental com uso de animais acordados evita os efeitos da anestesia, bem como influências na neurotransmissão causadas pelo anestésico, efeitos que podem justificar algumas das divergências encontradas na literatura quanto à ação do NO na neuromodulação cardiovascular, uma vez que anestésicos podem influenciar as respostas tanto qualitativamente quanto quantitativamente (Martins-Pinge e cols., 2007).
Avaliamos a eficácia do L-NAME em causar efeito protetor sobre o aumento da PAM evocado pelo GLU e a integridade funcional da RVLM após sucessivas microinjeções, assim, analisamos a manutenção das respostas induzidas pelo GLU antes e após microinjeção de PBS. Lesões na RVLM poderiam levar a alterações ou mesmo
36 ao colapso do sistema de controle da PA, bem como queda da PA, redução da atividade vasomotora simpática, abolição do componente vasomotor barorreceptor e do reflexo cardiopulmonar (Barraco, 1994). Para tal seguimos o protocolo de microinjeções de GLU na RVLM e encontramos respostas evocadas pelo GLU de mesma intensidade antes e após a microinjeção de PBS (Fig. 11). Estes achados reforçam que nos protocolos utilizados neste trabalho há integridade do sistema cardiovascular em regular as respostas cardiovasculares, especialmente, estes resultados salientam a evidência de que o pré-tratamento com L-NAME é capaz de atenuar a resposta pressora causada pela microinjeção de GLU (Fig. 09).
Visto que o L-NAME reduz a resposta pressora ao GLU, decidimos avaliar uma possível via de modulação do NO na RVLM, para isso investigamos a influência do NO sobre os subtipos de receptores ionotrópicos glutamatérgicos específicos: NMDA e AMPA. Nossos resultados mostraram o efeito atenuante do L-NAME sobre a resposta pressora evocada pelo agonista NMDA. Observamos que o NO participa da modulação das respostas cardiovasculares através de receptores NMDA na RVLM (Fig. 14). Um dos mecanismos possíveis de ação do NO sobre os receptores NMDA pode ocorrer pela estimulação da produção de NO pela nNOS em resposta ao um influxo de cálcio, desta forma o NO produzido pode exercer efeito sobre a S-nitrosilação de proteínas, incluindo os receptores NMDA, e sobre a ativação de guanilato ciclase/cGMP (Edwards e cols., 2004). O óxido nítrico ativaria sGC aumentando assim o nível de GMPc, no sistema nervoso o GMP pode atuar diretamente sobre os canais cálcio e sódio aumentando a taxa de disparo neuronal, ou atuar sobre proteínas quinases específicas (Wu e cols., 2001).
Pesquisadores mostraram ainda que o efeito evocado pelo NMDA de aumento da PA e produção de NO foram atenuados pelo tratamento com ODQ na RVLM de gatos anestesiados, o que demonstra a participação da via sGC/cGMP na modulação das respostas cardiovasculares (Wu e cols., 2001). Adicionalmente, achados sugerem que a ativação de receptores ionotrópicos NMDA, mas não receptores ionotrópicos AMPA ou receptores metabotrópicos, provocam a ativação de sGC e formação de cGMP para produzir respostas fisiológicas no NTS (Chianca et al., 2004).
Autores demostraram que a resposta pressora provocada pelos agonistas de receptores glutamatérgicos NMDA e AMPA são atenuadas após tratamento com
37 inibidores da NOS (Wu e cols., 2001; Chen e cols., 1997; Chen e cols., 2001). Alguns destes autores descrevem o NO como uma molécula envolvida na ativação de receptores NMDA e AMPA, porém, a interação entre o NO e os receptores NMDA é comparativamente mais bem definida do que a interação do NO com receptores AMPA (Chen et al., 2001; Chen et al., 1997).
Em nosso estudo, quando analisamos o papel do NO sobre os receptores glutamatérgicos ionotrópicos encontramos redução da resposta pressora à estimulação por agonista NMDA e AMPA após o tratamento com L-NAME quando comparados os picos máximos de aumento da PAM antes e após o uso do bloqueador da NOS, contudo observamos maior eficácia na prevenção do aumento da PAM evocado pela microinjeção de NMDA quando comparada à resposta produzida pelo agonista AMPA (Fig. 17). Não obstante, a duração da resposta apresenta diferença estatística somente para o grupo NMDA (Fig. 14) e não encontramos alteração da resposta pressora na análise temporal à estimulação evocada pelo AMPA após tratamento com L-NAME comparada à microinjeção de AMPA antes do bloqueio da NOS (Fig. 16). Diante destes resultados acreditamos que há maior interação e ação modulatória do NO sobre os receptores NMDA na regulação da pressão arterial pela RVLM. Não foram encontradas alterações em relação à FC antes comparada à após a microinjeção de L-NAME, bem como nos encontramos nas respostas produzidos glutamato no pré-tratamento com L- NAME. Como discutido anteriormente, é possível que o controle das respostas ao NO sobre a FC não seja regulada pela RVLM, mas sim por outro/outros núcleos centrais de controle da função cardiovascular.
A estimulação do receptor NMDA pode consequentemente facilitar a liberação de glutamato, o que, por sua vez, pode ativar receptores AMPA em neurônios contendo NOS e vice versa (Chen e cols., 2001). Nossos resultados indicam que a ação neuromodulatória do NO na via glutamatérgica ocorre prioritariamente sobre os receptores NMDA na RVLM, provavelmente devido ação direta de modulação do NO sobre estes receptores. Embora nossos resultados sugiram que receptores AMPA não sofram influência direta de modulação do NO, eles podem indiretamente ser influenciados pela modulação do NO sobre os receptores NMDA. Assim, após bloqueio da síntese de NO na RVLM há redução da resposta pressora ao NMDA e pequena diminuição da resposta pressora evocada pelo AMPA.
38 O presente estudo não abordou o mecanismo celular entre a ativação dos receptores de NMDA e o NO, mas uma possibilidade atraente é que NO pode ser gerado e atuar como um passo intermediário para ativação de sGC para formação de cGMP e que a formação de NO pode preceder a ativação de sGC e também à estimulação dos receptores NMDA.
A concepção de que NO tem ação durante a estimulação dos receptores NMDA, por meio da ativação da guanilato ciclase é atualmente estabelecida (Martins-Pinge e cols., 1999), Patel et al., (2001) propõem um mecanismo de ação pré-sináptica do NO no NTS, bem como a função direta da molécula de NO sobre os receptores NMDA. Com base na hipótese estabelecida por Patel, sugerimos uma via de modulação do NO por meio dos receptores NMDA em neurônios pós-sinápticos da RVLM (Fig. 18).
Fig 18. Representação esquemática da possível via de modulação pós sináptica do NO sobre os receptores NMDA. A ativação de receptores NMDA promovem influxo de cálcio, com consequente ativação da NOS, por meio da calmodulina. Há síntese de NO
39 e difusão desta molécula, a qual pode ativar receptores NMDA ou sGC, promovendo síntese de cGMP. cGMP pode desencadear diversos eventos celulares, bem como ativar diretamente canais iônicos e proteínas quinases específicas.
Entretanto, mais estudos tornam-se necessários para elucidar o mecanismo de modulação da pressão arterial através da estimulação induzida pelo NO e na formação de cGMP em centros de controle cardiovascular, tal como na região rostral do bulbo ventrolateral.
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6 - CONCLUSÕES
Estes resultados indicam que o NO possui ação simpatoexcitatória de regulação da pressão arterial pela via glutamatérgica na RVLM. Além disso, observamos que NO influencia as respostas cardiovasculares pela modulação dos receptores NMDA presentes na RVLM.
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