O estudo do fosfatidilinositol e de seus metabólitos tem se revelado nos últimos anos um promissor campo de investigação, sobretudo, com a constatação de que estas substâncias não desempenham apenas um papel estrutural, sendo também considerados precursores de mensageiros secundários envolvidos nos processos de sinalização intracelular (Balsinde et al. 1999). Em leveduras, estão relacionados à regulação transcricional, remodelamento da cromatina, exportação nuclear do RNAm, manutenção da elongação telomérica, mecanismos de reparo do DNA, tráfego vesicular, proliferação celular, além da secreção da enzima invertase e regulação de vias de sinalização dependentes de glicose, sobre os quais existem poucos relatos na literatura (Kaibuchi et al., 1986; Flick & Thorner, 1993; Brandão et al.,1994; Cocetti et al., 1998; Chi et al., 2004; York, 2006; Trópia et al., 2006).
O interesse inicial do nosso grupo de trabalho nessa via metabólica foi decorrente de várias evidências indicando que a ativação induzida por glicose da H+-
ATPase de membrana citoplasmática em células de S. cerevisiae parece ser dependente, ainda que parcialmente, de um mecanismo envolvendo metabolização de fosfatidilinositol (Cocetti et al., 1998; Souza et al., 2001; Trópia et al., 2006). Experimentos preliminares realizados para definir as melhores condições de obtenção de células para esse tipo de estudo indicaram que a cepa com mutação no gene ARG82 não apresentava crescimento em meios contendo fontes alternativas de carbono.
Também por essa razão, decidimos investigar com maior atenção vias de sinalização dependentes de carboidratos em cepas de S. cerevisiae que continham deleção em genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo do fosfatidilinositol, especificamente na geração de inositóis fosfatos (PLC1, ARG82, IPK1 e KCS1), avaliando ainda se elas estariam envolvidas no metabolismo de fontes alternativas de carbono e no controle da expressão gênica por glicose em leveduras.
Nossos resultados demonstraram que dentre todas as cepas mutantes aquela que apresentava fenótipos mais severos com relação ao metabolismo de fontes alternativas
de carbono e a expressão de genes controlados por glicose foi a cepa arg82Δ derivada do “background” PJ69-2a, ou seja:
• esse mutante não apresenta crescimento em fontes de carbono não ou parcialmente fermentáveis tais como galactose, glicerol e etanol;
• esse mutante não possui um perfil de crescimento clássico em glicose de uma cepa de S. cerevisiae, devido à ausência de uma segunda fase de crescimento, respiratória, caracterizada por menores taxas de consumo de etanol;
• quando avaliamos a expressão do gene SUC2 responsável pela codificação da enzima invertase e que é regulado exclusivamente por glicose, percebemos que o mutante possui deficiência quanto a desrepressão desse gene mesmo submetido a condições de desrepressão;
• a expressão dos elementos do sistema GAL está comprometida no mutante arg82Δ . Entretanto, os mesmos fenótipos não foram observados quando analisamos o mutante arg82Δ originado a partir do “background BY-series” (coleção EUROSCARF). Diante dessa discrepância de resultados, nossa primeira estratégia foi conferir se a construção desses mutantes estava de acordo com a descrição da literatura, ou seja, se houve a correta inserção do cassete KanMX4 na seqüência codificadora do gene ARG82 das cepas selvagens PJ69-2a e BY4742. Reações de PCR, demonstraram que não se tratava de um problema quanto à construção do mutante arg82Δ a partir dos “backgrounds” PJ69-2a e BY4742 sendo que em ambos os “backgrounds” o gene estava corretamente interrompido.
Nosso próximo passo foi promover novamente a deleção do gene ARG82 na cepa selvagem PJ69-2a com o propósito de verificar se os fenótipos obtidos para o mutante arg82Δ estariam relacionados à deleção desse gene, especificamente no “background” PJ69-2a. Para isso obtivemos a cepa LBCM 512, na qual observamos fenótipos semelhantes àqueles obtidos para o mutante arg82Δ (PJ69-2a). Esse resultado demonstrou que tais fenótipos estão associados a deleção do gene ARG82 e a um segundo fator característico do “background” PJ69-2a, uma vez que a cepa derivada do “background BY-series”, embora possuísse a correta interrupção do gene ARG82, não apresentou fenótipos compatíveis àqueles observados para o mutante arg82Δ , derivado do “background” PJ69-2a.
De acordo com Rogowska-Wrzesinska et al. (2001), cepas mutantes geradas a partir de projetos de análise funcional, como EUROFAN I e II, muitas vezes apresentam diferenças fenotípicas drásticas dependendo do tipo de “background” utilizado para a construção das mesmas. Esse grupo observou através da análise do padrão de expressão de proteínas que existem diferenças moleculares importantes entre os “backgrounds” CEN.PK2, FY1679 e W303, pois identificaram 62 proteínas que são diferentemente expressas entre eles. Concluíram ainda que FY1679 e W303 são mais similares quando comparados a CEN.PK2.
Outros trabalhos descrevem diferenças fenotípicas importantes encontradas em mutantes originados a partir de diferentes “backgrounds”. Lopez et al. (1998) demonstraram que a deleção do gene PKH2, que codifica uma proteína quinase serina/treonina envolvida na via de sinalização mediada por esfingolipídeos, é letal quando promovida na cepa selvagem CEN.PK2, porém não apresenta alterações relevantes quando realizada a partir da cepa FY1679. Rohde et al. (2000), por sua vez, citam que para que haja a completa indução de genes controlados por galactose é necessário que o fator transcricional Gal4p seja fosforilado no sítio Ser699, entretanto a realização de mutações nesse sítio promoveram um maior comprometimento na indução do sistema GAL quando realizadas em cepas derivadas do “background” FY1679 do que naquelas derivadas de W303, sugerindo que esses resultados, associados ao fato de que as cepas derivadas do “background” FY1679 respondem mais lentamente a galactose, refletem diferenças nos mecanismos de sinalização dependentes de galactose presentes nesses dois backgrounds.
Além disso, Dijken et al. (2000) citam que trabalhos não publicados de Francois & Gancedo demonstraram através de estudos de transdução de sinal que cepas da família CEN.PK quando expostas ao excesso de glicose não apresentam um acúmulo transiente de AMPc como ocorre em outras cepas derivadas de “backgrounds” diferentes.
Sugerimos, então, a partir desses dados da literatura que a diferença fenotípica encontrada entre os mutantes arg82Δ com os quais trabalhamos pode ter sido ocasionada a partir de diferenças moleculares específicas dos “backgrounds” (PJ69-2a e “BY-series”) a partir dos quais esses mutantes foram obtidos.
Considerando então que a cepa PJ69-2a possua um padrão de expressão protéica, uma mutação ou ainda outros fatores que em conjunto com a deleção arg82Δ sejam responsáveis pelos fenótipos apresentados podemos dizer que, embora mais severos, os mesmos são parcialmente compatíveis com aqueles apresentados pelo mutante pkc1 Δ e que já foram descritos por outros trabalhos do nosso laboratório. Brandão et al. (2002) demonstraram que no contexto da repressão por glicose, o mutante pkc1 Δ quando comparado com a cepa selvagem, apresenta baixa capacidade respiratória, baixo ou lento crescimento em glicerol, galactose ou rafinose. Esse mutante ainda apresenta problemas na despressão da atividade da enzima invertase em conseqüência de uma alteração na expressão do gene SUC2, após a transferência das células de um meio de cultura contendo glicose para um meio contendo rafinose. Entretanto, a única diferença encontrada entre os fenótipos descritos para os mutantes
arg82Δ e pkc1Δ se baseia na expressão do sistema GAL, uma vez que diferentemente de pkc1Δ , o mutante arg82Δ contendo o plasmídeo pBM690 (GAL1::lacZ) apresentou
baixa atividade de β-galactosidase, sugerindo que nesse mutante o mecanismo de repressão por glicose opera na transcrição de componentes do sistema GAL.
Salgado et al. (2002) e Gomes et al. (2005) sugerem que Pkc1 p estaria atuando através da via de principal de repressão por glicose por promover o controle da localização subcelular do respressor Mig1 p através de duas possibilidades: Pkc1 p poderia fosforilar diretamente Mig1p o que facilitaria a sua translocação do núcleo para o citoplasma ou ainda que Pkc1 p poderia ativar um fator desconhecido envolvido na regulação de fatores de translocação como a exportina Msn5 p que transportaria Mig1 p do núcleo para o citoplasma. Os autores sugerem ainda que a proteína Hos2 p (uma histona deacetilase), que afeta a organização da cromatina, participa de alguma forma desta via de sinalização.
Portanto, a partir das semelhanças fenotípicas entre arg82Δ e pkc1Δ , nossa hipótese de trabalho inicial foi de que as proteínas Arg82p e Pkc1p de S. cerevisiae poderiam compartilhar vias de sinalização e possuir alvos finais semelhantes. Esta hipótese, além de ter fundamento no modelo proposto por Salgado et al. (2002) e Gomes et al. (2005), considera as evidências de que em Arabidopsis thaliana a proteína Arg82 p pode ser fosforilada pela proteína quinase C “in vitro” (Xia &Yang, 2005) e
que em Schizosaccharomyces pombe a fosforilação do repressor Mig1 p seria mediada por componentes do metabolismo do fosfatdilinositol, controlando, assim, a expressão do gene INV+, que codifica a enzima invertase nesse microorganismo (Chi et al., 2004).
Sabe-se que a ausência da proteína Arg82p gera o acúmulo do inositol 1,4,5 – trifosfato (IP3) (Saiardi et al. 2000), logo analisando se esse seria o fator responsável
pelos fenótipos apresentados por arg82Δ com relação à utilização de fontes alternativas de carbono e expressão de genes controlados por glicose, construímos o duplo mutante
arg82Δ plc1Δ , esperando que houvesse uma reversão dos fenótipos apresentados por arg82Δ , uma vez que a deleção de PLC1 no mutante arg82Δ promove uma redução nos
níveis de IP3 apresentados por esse mutante (Resnick et al. 2005). Entretanto, o duplo
mutante arg82Δ plc1Δ não apresentou crescimento em fontes alternativas de carbono, o que nos permite inferir que a ausência da proteína Arg82p, associada a um segundo fator característico do “background” PJ69-2a, e não o acúmulo do IP3 característico da
cepa arg82Δ , seriam os responsáveis pela participação do metabolismo do fosfatidilinositol no controle do metabolismo de fontes alternativas de carbono e expressão de genes sob o controle de glicose.
Paralelamente à essa análise, um outro indício que nos permitiu detectar discrepâncias fenotípicas entre os mutantes arg82Δ derivados de diferentes “backgrounds” (PJ69-2a e “BY series”) foi a medida da acidificação extracelular induzida por glicose mediada pela ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática
de leveduras.
Como já mencionado anteriormente, uma das principais linhas de pesquisa de nosso laboratório consiste no estudo do mecanismo pelo qual a adição de glicose às células de S. cerevisiae leva a ativação pós-transcricional da H+-ATPase de membrana citoplasmática. Resultados obtidos recentemente permitiram que nosso grupo propusesse um modelo hipotético em que há uma clara conexão entre o sinal intracelular de cálcio, induzido por glicose, e a regulação pós-transcricional dessa
proteína (Trópia et al., 2006). A abordagem feita por esse modelo hipotético em relação ao possível
envolvimento do metabolismo do fosfatidilinositol consiste na participação do inositol trifosfato (IP3) como mensageiro na resposta intracelular de cálcio e posterior ativação
da H+-ATPase. Essa conclusão provém da evidência de que o mutante arg82∆derivado
do “background” PJ69-2a e que possui altos níveis de IP3, apresentou tanto a
acidificação externa quanto a ativação enzimática da H+-ATPase, ambas induzidas por glicose, mais intensas quando comparado à cepa selvagem correspondente (Trópia et al. 2006). O inositol trifosfato por sua vez, atuaria sobre canais de cálcio presente na membrana citoplasmática e/ou na membrana de organelas intracelulares, levando a uma elevação dos níveis de cálcio livre no citosol; por este modelo, o cálcio associado à ação do mensageiro secundário diacilglicerol (DAG) promoveriam a ativação da proteína quinase C (Pkc1 p), culminando com a ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática por glicose (Trópia et al., 2006).
Portanto, a partir desse modelo proposto por Trópia et al. (2006) e da inviabilidade de crescimento em fontes alternativas de carbono apresentadas por
arg82Δ , decidimos avaliar a possível participação do metabolismo do fosfatidilinositol,
em conexão com o metabolismo do cálcio, tanto no processo de ativação da H+-ATPase de membrana citoplasmática por glicose como no metabolismo de fontes de carbono.
Assim, baseados no fato de que não existem relatos de que o genoma de leveduras apresente um receptor homólogo aos receptores para IP3 encontrados em
mamíferos (Wera et al., 2001) e na hipótese de que o IP3 atuaria sobre canais de cálcio
presente na membrana citoplasmática e/ou na membrana de organelas intracelulares promovendo a liberação de cálcio para o citosol (Trópia et al. 2006), decidimos avaliar se a deleção do gene YVC1, que codifica para o canal vacuolar de cálcio, associada a deleção do gene ARG82 promoveria alterações quanto à intensidade da acidificação externa nesse duplo mutante bem como nos fenótipos apresentados com relação ao crescimento em fontes alternativas de carbono.
A intensidade da acidificação extracelular no duplo mutante arg82∆yvc1∆ e na
cepa selvagem PJ69-2a foram inferiores àquela obtida para arg82∆ havendo ainda reversão dos fenótipos de crescimento em fontes alternativas de carbono. Esses resultados sugerem que no “background PJ69-2a”, a Yvc1 p seria por hipótese mais sensível ao IP3 do que no “background BY-series”. Dessa forma, sua deleção impediria
uma maior liberação de cálcio para o citoplasma da célula, culminando com uma menor ativação de Pkc1 p e da H+-ATPase gerando, conseqüentemente, uma acidificação
extracelular menos intensa.
Desta forma, estabelecemos a hipótese de que a Yvc1 p seria uma candidata ao receptor de IP3 em leveduras, uma vez que ainda não existem relatos de que o genoma de leveduras apresente um receptor homólogo aos receptores para IP3 encontrados em
mamíferos (Wera et al., 2001), porém outros estudos precisam ser realizados para uma melhor elucidação desse aspecto.
Como descrito anteriormente e diferentemente do fenótipo apresentado por
arg82∆yvc1∆ em relação ao crescimento em fontes alternativas de carbono, a deleção
de PLC1 no mutante arg82Δ , não promoveu a reversão do fenótipo obtido por arg82∆,
indicando que o acúmulo do IP3 característico desse mutante não seria o responsável
direto pelos resultados obtidos para o mutante construído a partir do “background PJ69- 2a”. Esse resultado, de certa forma, estaria contrapondo a nossa hipótese de que através de uma sensibilidade exacerbada de Yvc1p pelo IP3 e o conseqüente acúmulo de cálcio
presente no mutante arg82∆ seriam responsáveis pelos fenótipos observados, entretanto nos abriria a perspectiva de que devido a versatilidade funcional de Arg82p, já descrita na literatura, essa proteína poderia também estar atuando por uma via independente do metabolismo do cálcio no controle do metabolismo de fontes alternativas de carbono e expressão gênica por glicose.
Portanto, o conjunto de nossos resultados demonstra que o metabolismo do fosfatidilinositol seja pela proteína Arg82p em si ou pelo seu envolvimento na metabolização do IP3, que por sua vez atua como mensageiro na resposta intracelular de
cálcio, está relacionado tanto ao metabolismo de fontes alternativas de carbono e expressão gênica regulada por glicose quanto na ativação, induzida por glicose, da H+-
ATPase de membrana citoplasmática de leveduras. Entretanto, os resultados obtidos não permitem elucidar completamente os mecanismos através dos quais se dá essa relação sendo necessário não somente a pontuação das diferenças moleculares específicas dos “backgrounds” PJ69-2a e “BY-series” como também a realização de experimentos que nos permitam avaliar o metabolismo do cálcio nas cepas mutantes e selvagens com as quais trabalhamos e identificar de que forma a proteína Arg82p agiria diretamente nos processos celulares avaliados nessa dissertação.