KAPITTEL 4 TEORETISKE ANALYSERAMMER
4.5 Forskning med relevans for denne studien
5.7.1.
Obtenção e preparo do RNA.Para a análise transcriptômica utilizou-se RNA total de 3 glândulas de veneno extraídas 4 dias após a extração manual do veneno, e RNA total de 3 glândulas de veneno de animais tratados com reserpina extraídas 4 dias após a extração manual de veneno.
O RNA total foi tratado com DNase I, Amplication Grade (Invitrogen), seguindo protocolo do fabricante.
O RNA total foi precipitado com isopropanol e em seguida foi feita a purificação do RNA mensageiro utilizando o Micro-FastTrackTM 2.0 Kit (Invitrogen).
Para quantificar o mRNA, avaliar seu grau de integridade e pureza foi usado o RNA 6000 Pico Chip no Agilent 2100 Bioanalyzer.
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5.7.2.
Construção da biblioteca de cDNA.Todos os procedimentos desde a construção da biblioteca até o sequenciamento foram realizados pela “Unidade de Genômica Computacional Darcy Fontoura de Almeida, Laboratorio de Bioinformática do LNCC (Laboratório Nacional de Computação Científica”.
Para a construção da biblioteca são necessários pelo menos 200ng de mRNA. A construção da biblioteca seguiu o protocolo do cDNA Rapid Library Preparation (Roche).
Primeiro o mRNA sofre fragmentação por Cloreto de Zinco. Os tamanhos dos fragmentos formados são analisados no RNA 6000 Pico Chip no Agilent 2100 Bioanalyzer.
Ao mRNA fragmentado adiciona-se Roche Primer “random”, a síntese da primeira fita de cDNA é realizada pela enzima AMV RT (Roche).
A síntese da segunda fita de cDNA é feita pelas enzimas 2nd strand enzime e T4 DNA Polymerase (Roche).
O cDNA dupla fita é purificado utilizando-se as AMPure beads (Roche) e um Concentrador de Partículas Magnéticas.
As moléculas de cDNA se ligam às beads e permanecem ligados a elas enquanto ocorrem as lavagens para eliminar os restos das reações enzimáticas, o concentrador de partículas magnéticas mantêm as beads unidas à parede do tubo enquanto ocorrem essas lavagens, no fim do processo adiciona-se solução de Tris-HCl para recuperar o cDNA purificado.
O cDNA purificado é tratado com o End repair mix (Roche) para adição de um grupo fosfato na extremidade 5’ e então ocorre a ligação do adaptador RL Adaptor (Roche).
Os fragmentos muito pequenos são removidos utilizando as AMPure beads tratadas previamente com Sizing Solution (Roche).
A biblioteca é quantificada através de emissão de fluorescência do adaptador ligado ao cDNA.
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A qualidade da biblioteca é avaliada no Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip.
Uma alíquota da biblioteca é diluída em tampão TE na concentração de 1 x 107 moléculas.µl-1. Essa solução é então aliquotada e armazenada entre -15°C e -25°C por até dois meses.
5.7.3.
Amplificação clonal baseada em emulsão (emPCR).O processo de amplificação emPCR foi feito de acordo com o protocolo descrito em GS FLX Titanium emPCR Method Manual (Roche).
O número de moléculas de cDNA necessárias para que ocorra a amplificação ótima é determinado por titulação.
O cDNA é então desnaturado, ligado às microesferas e emulsionado em uma mistura de água e óleo com reagentes de PCR para amplificação clonal do fragmento.
Na PCR em emulsão, o óleo em solução aquosa forma micelas, nas quais as microesferas são capturadas. Cada micela funcionará como um microrreator, produzindo muitas cópias idênticas de um mesmo fragmento isoladamente em um microssuporte.
Após a reação de PCR as microesferas sofrem uma série de lavagens e são recuperadas para então serem submetidas ao processo de enriquecimento, a fim de aumentar a porcentagem de microesferas contendo cDNA marcado.
As microesferas enriquecidas são então preparadas para a reação de sequenciamento.
5.7.4.
Sequenciamento.O sequenciamento das amostras foi realizado no Genome Sequencer FLX Instrument and System (454 Life Science Corporation – Roche), conforme especificações do fabricante.
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5.7.5.
Análises dos dados do sequenciamento.As sequências foram tratadas com o software CLC Genomics Workbench (http://www.clcbio.com/genomics/) para eliminação da sequência do adaptador e das regiões da baixa qualidade, além da eliminação das sequências de rRNA.
As sequências provenientes de um sequenciamento prévio de pâncreas e glândula de veneno de Bothrops jararaca foram agrupadas com o programa GS De Novo Assembler (Roche) formando contigs de pâncreas e glândula de veneno, depois esses contigs foram transportados para o programa CLC e os contigs em comum entre os dois tecidos foram agrupados em um só, assim foi construído um banco de referência de transcritos. Foi aplicado um filtro contra genes ribossomais a fim de identificar sequências que não foram retiradas na primeira “limpeza”. As sequências (reads) provenientes do sequenciamento das glândulas de veneno normal e tratada com reserpina foram mapeadas usando o banco de referência de transcritos previamente construído. Os clusters formados foram submetidos ao programa Blast2go (CONESA et al., 2005), primeiro foi realizado a busca por BlastX contra um banco de toxinas compilado pelo nosso laboratório, depois BlastN contra esse mesmo banco, para identificar primeiro as toxinas. Em seguida foi realizado a busca por BlastX contra o banco de transcritos do genebank e em seguida busca por BlastN para aquelas sequências que não foram identificadas por BlastX. Para a identificação putativa foi adotado um valor mínimo de confiabilidade (e-value) de 10-3.
Os transcritos foram funcionalmente anotados e classificados usando termos do Gene Ontology (ASHBURNER et al., 2000).
Para determinar os valores de expressão dos contigs e identificar os genes diferencialmente expressos foi utilizado o software CLC Genomics Workbench – RNA- seq module. O valor expressão de um gene é representado por RPKM (reads per kilobase per million mappead reads) (MORTAZAVI et al., 2008), segundo a fórmula:
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Total exon reads é o número de reads que foram mapeadas na região na qual um exon está anotado para um gene, ou nos limites de dois exons ou um intron e um exon para um transcrito anotado de um gene.
Exon lenght é calculado como a soma dos tamanhos de todos os exons anotados para o gene. Cada exon é incluído somente uma vez nessa soma, mesmo se ele estiver presente em mais transcritos anotados do gene. Exons parcialmente sobrepostos terão seu tamanho total contado, mesmo se eles compartilharem a mesma região.
Mapped reads é a soma do total de reads que foram mapeadas na região do gene por amostra.
Para as análises estatísticas foi realizado o tests on proportions seguido do Z-test (KAL et al., 1999).
Foram considerados diferencialmente expressos genes com p-value < 0,05, e genes cujo valor de expressão foi zero para uma das duas amostras sequenciadas foram considerados exclusivos da outra amostra.
Os genes diferencialmente expressos e exclusivos foram submetidos à análise de enriquecimento de termos do GO (Fisher´s exact test) no programa Blast2go. Foram consideradas enriquecidas categorias com p-value menor que 5% (p-value < 0,05).
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