Muitos fármacos disponíveis para o uso clínico interagem diretamente com o ergosterol, ocasionando a ruptura da membrana celular fúngica e perda de conteúdo intracelular. Para determinar se os monoterpenos se ligam a esteróis da membrana fúngica, a CIM dos produtos para C. albicans e C. tropicalis foi determinada com e sem a adição de ergosterol. Se a atividade do monoterpeno for causada pela ligação ao ergosterol, o ergosterol exógeno impedirá a ligação com o ergosterol da membrana fúngica e como consequência, a CIM desse produto tende a aumentar na presença do ergosterol exógeno em relação ao ensaio controle. Caso a CIM do produto permaneça inalterada na presença de diferentes concentrações exógenas de ergosterol, sugere-se que este composto não age ligando-se ao ergosterol da membrana.
O ergosterol foi preparado no momento da execução do teste, onde primeiramente foi pulverizado (com auxílio de cadinho de porcelana e um pistilo previamente esterilizados) e dissolvidos em DMSO (não mais que 10% do volume final) e Tween 80 a 1%, de acordo com o volume e concentração desejada. A emulsão formada foi então homogeinizada, aquecida para aumentar a solubilidade e diluída com o meio de cultura líquido.
A determinação da CIM dos monoterpenos contra cepas de C. albicans e C. tropicalis foi realizada por microdiluição, utilizando placas de microtitulação contendo 96 cavidades, com fundo em forma de “U” semelhante ao protocolo descrito no item 3.8. O meio de cultura RPMI-1640 foi utilizado na ausência e na presença de 400 µg/mL de ergosterol. Por fim, foi realizado o mesmo procedimento com a anfotericina B, cuja interação com ergosterol já é conhecida, para servir como uma droga controle. As placas foram seladas e incubadas a 35°C por 24-48 horas para ser realizada a leitura (ESCALANTE et al., 2008; LUNDE; KUBO, 2000).
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APÊNDICE A – Artigo publicado
INVESTIGANDO A ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DO GERANIOL CONTRA CEPAS DE Candida albicans