4.4.1. Procedimentos de colheita.
Eram coletadas individualmente em sacos estéreis, após o chuveiro final da seção de evisceração, 05 carcaças de frango. As colheitas aconteciam
aproximadamente uma hora e vinte e um minutos, antes do final de cada turno de abate. O tempo da colheita correspondia ao tempo de processo do sistema de pré- resfriamento, ou seja, o tempo que as carcaças levavam para percorrer da entrada do primeiro estágio do sistema de pré-resfriamento até sua saída no último estágio (terceiro estágio). Desta forma, as colheitas de carcaças antes e após o sistema de pré-resfriamento eram do mesmo lote ou aviário de produção de frangos.
O tempo das colheitas tinha variações conforme as velocidades da linha de abate:
Velocidade 120 frangos por minuto = 1:21:48 h Velocidade 130 frangos por minuto = 1:21:12 h Velocidade 140 frangos por minuto = 1:20:48 h Velocidade 150 frangos por minuto = 1:20:24 h
Durante as colheitas eram utilizadas luvas descartáveis estéreis. Os sacos com as carcaças eram encaminhados imediatamente ao laboratório do matadouro e o prazo máximo entre a colheita e a realização das análises era de 15 minutos.
4.4.2. Procedimentos para pesquisa de Salmonella spp. por reação em cadeia da polimerase (PCR).
No laboratório, as superfícies dos sacos plásticos contendo as carcaças eram sanitizados com álcool 70%. Em seguida eram abertos e assepticamente eram retiradas de cada carcaça 5 gramas, totalizando assim, 25 + 0,2 gramas(pool das 5 carcaças) como unidade analítica, as quais, sempre eram compostas por pele e músculo das regiões pericloacal, asas e pescoço. A unidade analíticaera depositada em bolsa estéril, na qual, eram adicionados 225 mL de água peptonada tamponada estéril 1% (Merck®). A partir disto, a amostra era homogeneizada em stomacher por 2 minutos em rotação de 260 RPM e em seguida, incubadas a 36 ºC + 1ºC por 24 horas.
A sequencia dos procedimentos para detecção de Salmonella spp. por reação em cadeia da polimerase (PCR), foram efetuados conforme o item 4.1.2 deste trabalho.
Os procedimentos para pesquisa de Salmonella spp. em metodologia convencional, identificação bioquímica, reação sorológica e sorotipagem, foram realizados conforme os itens 4.1.3, 4.1.4, 4.1.5 e 4.1.6.
4.4.3. Procedimentos para contagem padrão de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis.
As contagens foram determinadas através de placas de petrifilmTM 3M para contagem de aeróbios. Partindo da amostra homogeneizada que foi preparada para a análise de Salmonella spp. por reação em cadeia da polimerase, foi utilizado a aliquota de 1 mL de amostra diluída em solução salina 0,1% estéril até 10-4. O inóculo foi dispensado no centro inferior da placa de petrifilm para contagem de aeróbios. O filme superior da placa era abaixado lentamente sobre a amostra diluída para evitar a formação e apreensão de bolhas de ar. Em seguida, a placa era comprimida por difusor plástico para distribuição circular e uniforme da amostra. Após remoção do difusor, a placa era mantida em repouso durante pelo menos um minuto para permitir a solidificação do gel. Em seguida, a placa era incubada a 35ºC + 1ºC, na posição horizontal, com o lado do inoculo para cima por 48 h + 3 h. Através de contador de colônias, as colônias vermelhas, independente do tamanho ou intensidade, eram consideradas como aeróbios. Os resultados foram expressos em UFC/g (FDA, 1998).
4.4.4. Procedimentos para contagem de coliformes totais e Escherichia coli. As contagens foram determinadas através de placas de petrifilmTM 3M para contagem de Escherichia coli e coliformes totais. Partindo da amostra homogeneizada que foi preparada para as análises de Salmonella spp. por reação em cadeia da polimerase, foi utilizado a alíquota de 1 mL de amostra diluída em solução salina 0,1% estéril até 10-2. O inóculo foi dispensado no centro inferior do filme da placa de petrifilm para contagem de E.coli e coliformes totais. O filme superior da placa era abaixado lentamente sobre a amostra diluída para evitar a formação e apreensão de bolhas de ar. Em seguida, a placa era comprimida por difusor plástico para distribuição circular e uniforme da amostra. Após remoção do difusor, a placa era mantida em repouso durante pelo menos um minuto para permitir a solidificação do gel. Em seguida, a placa era incubada a 35ºC + 1ºC, na posição horizontal, com o lado do inoculo para cima por 24 h ± 2 h. Através de
contador de colônias, as colônias azuis a vermelha azuladas e associadas ao gás formado dentro do diâmetro da colônia, independente de tamanho ou intensidade de cor, eram consideradas como Escherichi coli. As colônias de coliformes totais consistiam da somatória das colônias azuis a vermelhas azuladas associadas ao gás formado dentro do diâmetro da colônia e as colônias vermelhas associadas ao gás formado dentro do diâmetro da colônia. Os resultados foram expressos em UFC/g (FDA, 1998).
4.4.5. Procedimentos para contagem de enterobacteriaceae.
As contagens foram determinadas através de placas de petrifilmTM 3M para Enterobacteriaceae. Partindo da amostra homogeneizada que foi preparada para as análises de Salmonella spp. por reação em cadeia da polimerase, foi utilizado a alíquota de 1 mL de amostra diluída em solução salina 0,1% estéril até 10-3. O inóculo foi dispensado no centro inferior do filme da placa de petrifilm para contagem de Enterobacteriaceae. O filme superior da placa era abaixado lentamente sobre a amostra diluída para evitar a formação e apreensão de bolhas de ar. Em seguida, à placa era comprimida por difusor plástico para distribuição circular e uniforme da amostra. Após remoção do difusor, a placa era mantida em repouso durante pelo menos um minuto para permitir a solidificação do gel. Em seguida, a placa era incubada a 35ºC + 1ºC, na posição horizontal, com o lado inoculo para cima por 24 h ± 2 h. Através de contador de colônias, as colônias vermelhas com zonas amarelas e colônias vermelhas com bolhas de gás com ou sem zonas amarelas eram consideradas como enterobacteriaceae. Os resultados foram expressos em UFC/g (FDA, 1998).