A leishmaniose visceral acomete muitas regiões do Brasil, incluindo o Estado do Rio Grande do Norte, onde houve um aumento de casos nos anos de 1992 e 2001 (JERONIMO et al., 1994; LIMA et al., 2012). A incidência da LV é maior para o gênero masculino na faixa etária acima de 10 anos (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2006). Uma explicação para esse fato parece ser, em parte, devido a diferenças hormonais que influenciam o tipo de resposta imunológica em homens e mulheres (ROBERTS; WALKER; ALEXANDER, 2001; SNIDER et al., 2009). Essa predominância de casos sintomáticos no sexo masculino, em parte, está refletida no grupo de voluntários com LV arrolados aleatoriamente no estudo, no qual foi encontrada uma frequência de 81% de pacientes do sexo masculino. No entanto, um estudo realizado no perímetro metropolitano de Natal, não revelou diferença na taxa de infecção por Leishmania infantum entre homens e mulheres que evoluíram sem doença, mostrando assim que o risco de infecção é o mesmo (LIMA et al., 2012),
A infecção por L. infantum já foi relacionada à presença de cães em casa, maior soropositividade de cães em áreas próximas, nível socioeconômico mais baixo e áreas cercadas de vegetação (BELO et al., 2013). Na América Latina, os cães (Canis familiaris) são tradicionalmente considerados o principal reservatório peridomiciliar para LV (ROMERO; BOELAERT, 2010), no entanto estudo recente na área metropolitana de Natal não revelou associação entre a presença de cães infectados na casa e a infecção humana por L. infantum (LIMA et al., 2012). Dentre os pacientes voluntários recrutados no presente estudo apenas 50% possuíam cão em casa. Por outro lado, cães são frequentemente mantidos fora da casa, além da existência de muitos cães sem donos nessas regiões, sendo uma avaliação em nível de bairro mais eficiente, onde estudo prévio revelou uma sobreposição geográfica de soropositividade em humanos e cães (BELO et al., 2013).
Por se tratar de uma região endêmica para LV, o diagnóstico clínico, acompanhado do laboratorial é suficiente para definição do quadro do paciente assim como o início do tratamento. A observação direta do parasita ao microscópio é o padrão ouro do diagnóstico, contudo a punção medular é uma técnica invasiva e, por isso, somente foi realizado em 10 dos 16 pacientes arrolados no estudo. Mesmo sendo o exame microscópico do aspirado medular um método de alta sensibilidade (78 a 94%) (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2006), em 4 dos 10
pacientes submetidos, não foi observada a presença de Leishmania spp. Nesse caso, uma avaliação indireta da presença de leishmânia como a detecção de IgG anti-L. infantum pode ser importante no diagnóstico.
Durante o recrutamento dos pacientes, foi adotado como critério de exclusão o teste rápido para HIV e diagnóstico de esquistossomose positivos. A exclusão de pacientes com doenças que podem ter um efeito confundidor na resposta imunológica é importante durante o desenho de estudo. Contudo, devido ao caráter oportunista das leishmanioses (BADARÓ et al., 1986; DELETONA, 1986; FERREIRA; BORGES, 2002), muitos pacientes arrolados possuíam algum imunocomprometimento, ou mesmo comportamento, que poderia influenciar a resposta imunológica como um paciente transplantado renal, um paciente usuário de drogas e um paciente alcoólatra .
Como já mencionado, apenas uma pequena proporção de indivíduos infectados por Leishmania spp. desenvolvem a doença ativa, na qual a resposta imunológica encontra-se fortemente alterada (GOTO; PRIANTI, 2009). Sendo assim, a caracterização da resposta imunológica na infecção pela leishmânia, tanto na LV quanto na infecção assintomática, revela-se não somente relevante para a compreensão dos mecanismos imunopatogênicos da doença, como também nos futuros estudos de imunomodulação. Para isso, foram selecionados indivíduos provenientes da mesma região, que moravam próximo ou na mesma casa de um caso de LV. Na escolha dos controles foi considerado importante a seleção de indivíduos submetidos as mesmas variáveis ambientais e socioeconômicas que os casos. Como esperado, os indivíduos do grupo Controles Positivo apresentaram níveis de IgG significativamente menores que o grupo LV ativa.
Baseado na dificuldade de correlação da clínica com os níveis de imunoglobulina, a utilização de novos instrumentos de avaliação indireta para facilitar o diagnóstico, assim como avaliar a resposta terapêutica ao tratamento, revela-se de grande importância. O PCR quantitativo constitui um método rápido e eficiente que pode ser utilizado de forma a facilitar o monitoramento da terapia antileishmânia, porém é uma ferramenta que tem sido pouco utilizada (VERMA et al., 2010). A utilização do KDNA como alvo nos ensaios de PCR quantitativo aumentou muito a sensibilidade da técnica, que passou a detectar menos de 1 parasita∕mL de sangue (MARY et al., 2004). O outro iniciador utilizado foi o Mag-1
que está associado ao gene MSP que codifica a proteína GP63 da Leishmaniainfantum, sendo esse iniciador importante na discriminação da espécie (MCCOY et al., 1998). A sensibilidade do KDNA-7 ocorre pelo fato das Leishmaniaspp. apresentarem um número elevado de cópias desse gene. Não foi observada variação no número de cópias desse gene entre amastigotas e promastigotas (WEIRATHER et al., 2011), de forma que a utilização de formas promastigotas na curva não inviabiliza a quantificação de amastigotas no sangue. Contudo, até mesmo diferentes cepas apresentaram variação no número de cópias desse gene e por isso essa quantificação através do KDNA-7 deve ser considerada como relativa (WEIRATHER et al., 2011). Com base no exposto, a utilização concomitante do KDNA-7 e iniciadores relativos a genes cromossomais como o Mag-1, utilizado no presente trabalho, revela-se de grande importância.
Mesmo sendo uma ferramenta importante, a utilização da técnica de PCR na quantificação da parasitemia deve ser cuidadosa, pois o teste com DNA obtido de uma única coleta de sangue nem sempre reflete a infecção sistêmica, visto que a leishmânia pode estar albergada em órgãos do paciente no momento da coleta, ou mesmo não estar presente no sangue periférico no local da coleta de sangue. Três dos indivíduos do grupo Controle Positivo apresentaram parasitemia equiparável a indivíduos com LV ativa, mostrando que pessoas com infecção assintomática podem ter transitoriamente quantidade elevada de microrganismos, mas terem sucesso no controle destes, sem apresentar sintomas aparentes. O cão (Canis familiaris) frequentemente apresenta alta carga parasitária em vários tecidos, principalmente pele e vísceras (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010), sendo por isso considerado um importante reservatório em alguns países como o Brasil. Contudo, essa elevada parasitemia encontrada por nós em indivíduos assintomáticos levanta questionamentos relacionados à importância humana no ciclo de transmissão da LV, visto que esse indivíduo já revelou ter um papel importante no ciclo de transmissão em alguns países da Ásia, onde a LV é considerada uma doença antroponótica (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
Experimentos in vitro utilizando o cultivo de macrófagos (MILES et al., 2005; NYLEN et al., 2007), assim como estudos avaliando sangue periférico de pacientes, (VERMA et al., 2010) têm mostrado uma correlação positiva entre níveis de IL-10 e a carga parasitária. No presente estudo não foi possível encontrar essa correlação,
entretanto, a quantidade de IL-10 no soro dos pacientes apresentou correlação positiva com a presença de anticorpos anti-L. infantum. Uma possível explicação está no fato de na LV, assim como na forma cutânea da leishmaniose, os macrófagos aumentarem a produção de IL-10 após a ativação por imunocomplexos (KANE; MOSSER, 2001; MILES et al., 2005; NYLÉN; SACKS, 2007).
Dentre o IgG total que encontra-se elevado nos indivíduos doentes, ocorre um predomínio de IgG1 e IgG3, como já descrito (CALDAS et al., 2005). Já os níveis de IgG2 e IgG4 não são diferentes dos controles. Sendo assim, o elevado nível de IgG total encontrado em pacientes é representado pelas subclasses IgG1 e IgG3. A citocina IL-10 também é implicada como tendo um importante papel nos elevados níveis de IgG1 e IgG3 encontrados nos pacientes, uma vez que essa citocina estimula a troca na produção por linfócitos B para essas subclasses (NYLÉN; SACKS, 2007).
O elevado nível sérico das enzimas hepáticas nas primeiras semanas de tratamento está associado ao envolvimento hepático pela ação da leishmânia (JERONIMO et al., 1994). As manifestações hepáticas podem ainda cursar com insuficiência hepática, causada pelo próprio parasita ou pela ação da droga, levando o paciente à óbito (DE-OLIVEIRA et al., 2010). A avaliação semanal, realizada durante o tratamento dos pacientes, revelou alteração do padrão normal para os níveis de TGO nas primeiras semanas seguido de diminuição para níveis normais na 4ª semana de tratamento; já os níveis de TGP só diminuíram na quarta semana, porém não foi encontrada diferença estatística entre os níveis semanais dessas enzimas hepáticas, assim como de proteínas totais que revelou apenas um discreto aumento.
O valor referência para a relação albumina ∕globulina é acima de 1,4, contudo pacientes com LV ativa, apresentam uma diminuição de proteínas totais, mais especificamente da albumina. Os níveis séricos de albumina já foi inversamente correlacionados à doença (MACIEL et al., 2008) e, como já descrito (GATTO et al., 2013), o presente trabalho descreve um aumento significativo nos níveis de albumina ao final do tratamento. Embora a imunossupressão seja marcante na LV, a hipergamaglobulinemia também é uma característica clínica desses pacientes nos quais ocorre uma resposta elevada de células B policlonais. Elas são responsáveis pelos altos títulos de imunoglobulinas, tanto específicas quanto inespecíficas para as Leishmania spp. (GOTO; PRIANTI, 2009). Os níveis de IgG mantiveram-se elevados
mesmo 14 meses após o tratamento, de modo que não foi surpresa encontrarmos os níveis de globulina mantendo–se acima do valor de referência, mesmo após o término do tratamento.
A parasitemia, avaliada semanalmente, não apresentou diferença significativa entre as semanas, contudo foi observada uma maior parasitemia, avaliando ambos os iniciadores, em pacientes durante a segunda semana de tratamento, seguido de uma diminuição nas semanas seguintes. Estudo avaliando pacientes tratados com Anfotericina B revelou uma diminuição considerável da parasitemia ainda na primeira semana de tratamento (MARY et al., 2006). Em parte, essa diferença pode ser devido ao mecanismo de ação dessas drogas. A Anfotericina B apresenta uma atividade leishmanicida mais direta que o Glucantime, visto que este último atua sobre uma via metabólica do parasita (SEIFERT, 2011; WYLLIE; CUNNINGHAM; FAIRLAMB, 2004).
O estudo da resposta imunológica tem sido classicamente determinado através da utilização da metodologia de purificação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Porém, há diferenças entre avaliação imunológica utilizando sangue total e CMSP (CARVALHO et al., 1992; NYLEN et al., 2007; SINGH et al., 2012), onde o processo de purificação de células brancas, principalmente em linfócitos CD8+, pode induzir um viés no perfil de ativação dessas células, assim
como uma variação na relação total de células CD4∕CD8 positivas. Por isso a avaliação de sangue total é considerada por alguns uma técnica mais acurada (APPAY et al., 2006).
Na comparação de diferentes estudos, vários fatores podem influenciar diferenças no perfil imunológico. Dentre esses, podemos citar não só diferenças em espécies de leishmânia como também nas cepas utilizadas na produção de antígeno. Da mesma forma, métodos de cultivo de células como pH do meio, quantidade de antígeno, dentre outros, podem levar à variação no perfil imunológico. Sendo assim, esperávamos encontrar diferenças apenas na avaliação de células após cultura, contudo, a despeito de todos esses fatores intervenientes, o presente estudo encontrou diferenças no perfil de ativação e memória de células CD4+ e
CD8+ quando comparado o perfil ex vivo com estudo realizado por outro grupo
utilizando pacientes infectados pela mesma espécie (CLARÊNCIO et al., 2009). Ademais, a utilização da cultura de sangue total é uma metodologia mais barata, mais rápida e que requer um menor volume de sangue, quando comparado à
utilização de CMSP. Não está ainda muito claro se fatores solúveis como receptor de IL-2 e CD14 (BARRAL-NETTO et al., 1991; SANTOS-OLIVEIRA et al., 2011), ou mesmo células como granulócitos, podem alterar essa resposta, contudo parece que a própria separação utilizando gradiente de Ficoll é capaz de alterar o perfil de marcadores extracelulares (APPAY et al., 2006).
Para uma melhor compreensão da importância de subpopulações de linfócitos ativados de memória assim como seu papel na produção de citocinas durante a doença ativa, um estudo detalhado foi realizado, avaliando a frequência dessas células em sangue total de pacientes durante a primeira semana de tratamento. Concluímos então que células CD4+ estão mais ativadas e apresentam maior perfil
de memória em cultura que células CD8. Apesar desse predomínio de células CD4 durante a doença, nenhuma alteração estímulo específica foi observada para esses linfócitos.
Tem sido demonstrado que o IFN-γ é crucial na resposta protetora contra numerosos parasitas intracelulares (SCHARTON-KERSTEN et al., 1996; SCHOFIELD et al., 1987; SUZUKI; CONLEY; REMINGTON, 1989; TORRICO et al., 1991) sendo essa citocina produzida principalmente por células CD4+, CD8+, assim como células NK. Dados publicados revelaram evidência de que a produção de IFNγ por células TCD8+ está relacionada à proteção contra doenças parasitárias
(GAZZINELLI et al., 1991; SHIRAHATA et al., 1994). No presente estudo, foi observado em indivíduos do grupo LV ativa que, em presença de antígeno, as células CD4+ tardiamente ativadas (CD25) são maiores produtoras de IFN-γ, quando
comparadas às células CD8+ tardiamente ativadas (CD25).
Na leishmaniose tegumentar, a citocina IL-10 pode tanto promover a proteção quanto o desenvolvimento de lesões, dependendo da cepa de Leishmania spp. (GOMES-SILVA et al., 2007; KANE; MOSSER, 2001); já na LV, essa citocina regulatória está relacionada à susceptibilidade à doença (NYLÉN; SACKS, 2007). Contrariamente, a IL-17 é uma citocina pró-inflamatória intimamente relacionada a doenças autoimunes (WEAVER et al., 2006) e a sua produção foi previamente relacionada à proteção na LV (PITTA et al., 2009). Foi observado no presente estudo que, em indivíduos doentes, linfócitos CD4+ recentemente ativados (CD69)
produzem mais IL-10, IL-17, assim como IFN-γ que linfócitos CD8+ recentemente
papel mais importante em relação à ativação, memória e produção de citocinas quando comparado a linfócitos CD8+. Contudo, o presente estudo mostrou também
que os linfócitos não são as células implicadas na produção de citocina IL-10 e IFN-γ Leishmania específica, encontrada elevada no sobrenadante de cultura de células de pacientes LV ativa, podendo estar a IL-10 sendo produzida por macrófagos e o IFN-γ sendo produzido por células NK em indivíduos doentes, visto que essas células, assim como os linfócitos, são importantes produtoras dessas citocinas.
Estudos mostraram que na fase ativa da LV ocorre uma deficiência na proliferação antígeno específica de linfócitos (CARVALHO et al., 1989; CARVALHO; TEIXEIRA; JOHNSON, 1981), assim como uma leucopenia intensa especialmente em linfócitos, com diminuição de linfócitos CD4+ e CD8+ (SANTOS-OLIVEIRA et al.,
2011). Apesar da leucopenia, foi observado ex vivo uma maior frequência de linfócitos CD4+ e CD8+ ativados em pacientes quando comparada aos grupos
controle, resultado esse contrário ao encontrado por Clarêncio e colaboradores que fizeram a separação prévia com gradiente Ficoll (CLARÊNCIO et al., 2009). Apesar de indivíduos do grupo LV ativa apresentarem uma maior frequência ex vivo de linfócitos ativados, essa ativação não é estímulo específica, como evidenciado após cultura, sendo mais uma vez esse resultado contrário ao encontrado na cultura de CMSP (CLARÊNCIO et al., 2009). Esses dados sugerem a existência de algum fator inibidor da ativação celular em cultura de sangue total de pacientes LV ativa. Um possível fator é o receptor de IL-2 solúvel, encontrado elevado em pacientes durante a LV (BARRAL-NETTO et al., 1991). Esse fator solúvel explicaria nossos achados de ausência de produção de IL-2 Leishmania específica em cultura de sangue total, assim como ausência de ativação estímulo específica frente ao antígeno de L.infantum.
A espécie humana apresenta uma maciça colonização do intestino por bactérias simbióticas, contudo possui barreiras que impedem a entrada dessas bactérias (BRENCHLEY; DOUEK, 2012). A quebra da barreira intestinal pode ocorrer devido a muitas doenças, como por exemplo a infecção pelos vírus HIV e pelos vírus da hepatite, assim como na infecção por Leishmania sp. (BRENCHLEY; DOUEK, 2012; SANDLER et al., 2011; SANTOS-OLIVEIRA et al., 2011). Essa quebra da barreira intestinal já foi relacionada a baixos níveis sérico de retinol (LIMA et al., 2010), e este último revelou estar associado à susceptibilidade na LV (MACIEL et al., 2008).
Estudo recente revelou níveis elevados de LPS no soro de pacientes LV ativa, sendo o LPS diretamente correlacionado com a presença de linfócitos ativados (SANTOS- OLIVEIRA et al., 2011), fato esse que corrobora com nossos achados de ativação linfocitária inespecífica porém elevada. Ademais, essa ativação de linfócitos em pacientes LV não parece ser efetiva pois não é capaz de controlar a parasitemia.
Na leishmaniose tegumentar as células CD8+ foram tanto relacionadas a um
papel protetor, sendo importante na produção de IFN-γ como descrito para leishmaniose cutânea (NATEGHI ROSTAMI et al., 2010), quanto um papel patogênico na leishmaniose mucosa (NOVAIS et al., 2013; SANTOS et al., 2013). Conforme relatado no presente estudo, em pacientes LV os linfócitos CD4+CD25+ e
CD8+CD25+ não produzem IFN-γ Leishmania específico. Contrariamente, linfócitos
CD8+CD25+ apresentaram uma importante produção de IFN-γ Leishmania
específica, tanto em indivíduos assintomáticos quanto em pacientes curados. Sendo assim, células CD8+CD25+ mostraram-se relacionadas a um perfil protetor na LV.
Nossos achados corroboram com estudo recente que revelou que linfócitos CD8+
apresentam um perfil anérgico, citotóxico e de exaustão, durante a doença, que é revertido após a cura, com a produção de IFN-γ Leishmania específico (GAUTAM et al., 2014).
Os estudos de vacina têm como base a possibilidade do desenvolvimento de uma memória imunológica duradoura, através da resposta imunológica adaptativa. Nesse contexto, linfócitos de CD4+ e CD8+ expressando marcador de memória
CD45RO+ são frequentemente avaliados em estudo de triagem de vacinas (SCOTT
et al., 2004). Na leishmaniose tegumentar, a manutenção das células de memória parece ser independente da persistência parasitária (ZAPH et al., 2004). Contudo a persistência de células de memória anti-leishmânia ainda não foi elucidada para leishmaniose visceral.
O recrutamento de células de memória para o sítio de infecção já foi descrito na leishmaniose tegumentar (SANTOS et al., 2013) assim como na leishmaniose visceral, onde nesta última, as células parecem migrar para a medula óssea (CLARÊNCIO et al., 2009). Essa migração tem sido utilizada para explicar a baixa frequência de linfócitos de memória no sangue periférico de pacientes LV quando avaliadas CMSP (CLARÊNCIO et al., 2009). O presente estudo não revelou alteração da frequência de linfócitos CD4 de memória no grupo LV ativa. Já a frequência de linfócitos CD8 de memória no sangue periférico de indivíduos doentes
está elevada, mas os linfócitos não são Leishmania específicos. Essa elevada frequência pode estar relacionada também à presença de LPS, explicando assim a ausência de proliferação frente ao antígeno de L. infantum. Indivíduos curados de LV apresentam teste de Montenegro positivo o que representa uma expansão de linfócitos de memória Leishmania específicos, contudo não foi encontrado aumento de células de memória Leishmania específicas, em indivíduos curados. Sendo assim, nossos dados corroboram com a hipótese de que esses linfócitos não estejam circulando e, sim, em órgão de indivíduos curados.
A diferenciação de linfócitos naive (CD45RA+) para linfócitos de memória
(CD45RO+) foi descrita, em estudo prévio, como associado à presença de IL-2
(ROTH, 1994), e os níveis plasmáticos de IL-2 revelaram-se elevados em pacientes LV (NYLEN et al., 2007). Esses dados corroboram com nossos achados de que existe uma elevada frequência de células CD8 de memória em pacientes LV, porém, assim como na produção de IL-2, esses linfócitos de memória não são Leishmania específicos. Após a cura, a frequência desses linfócitos diminuem no sangue periférico.
A importância do desenvolvimento de estudo longitudinal se encontra na possibilidade de se descartar possíveis características intrínsecas, variações individuais da resposta imunológica do hospedeiro como, por exemplo, a produção basal de citocinas. Essa importância é amplificada pela dificuldade de realização de estudo de citometria com uma coorte muito grande.
Como já descrito, foi encontrada uma discreta mas não significante diminuição nos níveis de IgG anti-SLA após 14 meses de cura, mas o mesmo não foi observado para o rK39, de forma que os níveis de anticorpos mantêm-se elevados após a cura (BRAZ et al., 2002). Em relação à cura parasitológica estéril, foi observada uma diminuição drástica da parasitemia 14 meses após o início do tratamento. Contudo, pela impossibilidade da busca de leishmânia em órgãos como baço e medula, não podemos correlacionar ausência de parasitemia com ausência de infecção parasitária. Sendo assim, a persistência da resposta humoral pode estar relacionada à persistência parasitária.
Outra característica que chama a atenção é o perfil de ativação ex vivo elevado