Composição centesimal: Os teores de umidade, cinzas, proteínas e lipídeos foram determinados segundo a AOAC (Association of official analytical chemists, 2005). A determinação dos teores de carboidratos totais foi realizada por diferença (FUCHS et al.,2005). O teor calórico dos produtos foi calculado com base no conteúdo de proteínas, lipídeos e carboidratos, utilizando a seguinte fórmula:
VCT (valor calórico total) = [proteínas (g) x 4)] + [carboidratos (g) x 4] + [lipídeos (g) x 9] Atividade de água: A atividade de água foi determinada em amostras previamente trituradas,
utilizando-se medidor de atividade de água (AQUALAB CX-2, EUA).
pH e Acidez titulável: As modificações do pH foram monitoradas em pHmetro (Qualxtron, modelo 8010, Brasil), em amostras preparadas pela mistura de 20g de salame e 80mL de água destilada. A acidez titulável foi determinada por titulação com NaOH (Synth, Brasil) 0,1N e espressa em mL de NaOH/100g (LIAROS; KATSANIDIS; BLOUKAS, 2009).
Perda de peso: Foi determinada pelo método gravimétrico, mediante a pesagem dos embutidos, imediatamente após o embutimento e nos períodos de fermentação, maturação e estocagem, sendo expressa como porcentagem do peso inicial (LIAROS; KATSANIDIS; BLOUKAS, 2009).
Cor: Foi determinada em colorímetro Hunterlab (Color Quest XE, EUA) no Laboratório de Controle de Qualidade de Alimentos da FCFAr – UNESP, utilizando iluminante D65 e ângulo visual de 10º. Valores de L*, a* e b* foram determinados como indicadores de luminosidade, índice de cor vermelha e índice de cor amarela, respectivamente (LIAROS; KATSANIDIS; BLOUKAS, 2009).
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Oxidação lipídica: A extensão da rancidez oxidativa foi determinada pelo teste do ácido tiobarbitúrico (TBA) (KOUTSOPOULOS; KOUTSIMANIS; BLOUKAS, 2008). Em um tubo de centrífuga, colocou-se 2 g de amostra, 5 mL de TBA (0,02M) e 10 mL de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 10%. Após centrifugação por 5 minutos a 3500 rpm, o sobrenadante foi filtrado em papel de filtro Whatman nº1 e uma alíquota de 8 mL do filtrado foi transferida para um tubo de ensaio de tampa rosqueável. Colocou-se o tubo em banho-maria por 35 minutos à 100ºC, para desenvolvimento da cor relativa à reação, sendo resfriado logo em seguida quando então a absorbância foi medida em espectrofotômetro à 532 nm. Foi realizada uma curva padrão a partir de uma solução estoque (1 x 10-3M) de 1,1,3,3 – tetraetoxipropano (TEP), utilizando concentrações de 10, 30, 40, 50, 60 e 70µl de TEP (GRAY, 1978).
Medida instrumental de textura: O perfil de textura foi avaliado utilizando um analisador de textura TA-XTplus (Stable micro systems, Reino Unido), através do teste TPA (Texture profile
analysis) no Laboratório de Farmacotécnica da FCFAr - UNESP (BOURNE, 1978). No modo
TPA, a prova analítica (10 mm de diâmetro) desce a uma velocidade constante de 1 mm/s, penetra 10 mm na amostra e volta até a sua superfície numa velocidade de 0,5 mm/s. Após este primeiro ciclo, a prova permanece em repouso por 5 s, quanto então inicia a segunda compressão (EXPONENT LITE, 2009). Foram avaliados os seguintes parâmetros: dureza, elasticidade, coesividade, gomosidade e mastigabilidade (LIAROS; KATSANIDIS; BLOUKAS, 2009).
Determinação de aminas bioativas: Foi realizada na UNICAM, em Camerino, na Itália. Alíquotas de 2,5 g das amostras foram homogeneizadas durante dois minutos, utilizando um Ultra-Turrax 18N S-G 10 (IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Alemanha) com 25 mL de TCA a 5% para extração das aminas bioativas (putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, espermina, espermidina, fenilalanina e triptamina) e centrifugou-se a 5000 rpm durante 10 min. Adicionou- se 5 ml de hexano e agitou-se em vortex durante 5 minutos, centrifugando a 5000 rpm durante
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10 min, e em seguida, a fase superior foi descartada e a fase inferior (solução ácida) foi filtrada. O processo de derivação com cloreto de dansil foi baseado no método proposto por Rea, et al (2005). Uma alíquota de 1 mL da solução ácida foi misturada com 200 L de NaOH 2 M, 300 L de uma solução saturada de NaHCO3, e 2 mL de cloreto de dansil (10 mg/mL de acetona). A reação de dansilação foi conduzida no escuro, a 40ºC durante 45 min, e sob agitação magnética. Em seguida, o cloreto de dansil residual foi destruído pela adição de 100 L de 28% de NH4OH. A mistura foi evaporada de modo a originar 1,6 mL sob fluxo de N2. O resíduo aquoso foi purificado em cartucho Strata C18-E (6 mL, 500 mg) que foi ativado com 2 x 2 mL de acetonitrila, condicionada com 2 x 2 ml de água. Em seguida o resíduo aquoso passou pelo cartucho a uma velocidade de 0,5 mL/min; o cartucho foi, então, lavado com 2 x 2 ml de água e secou-se completamente, em seguida a eluição foi realizada utilizando 4 mL de acetonitrila. O eluato foi filtrado em filtro de PTFE de 0,45 m, injetado em Cromatografo Líquido de Alta Eficiência, com detector DAD (diode array) (Hewlett Packard, HP-1090 Series II, EUA) (SAGRATINI et al., 2012 com modificações).
Determinação de perfil de ácidos graxos: Realizada no Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da FCF – USP. A quantificação de ácidos graxos foi precedida pela extração da fração lipídica (FOLCH; LEES; STANLEY, 1957) e, os ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) foram obtidos segundo método de Hartman e Lago adaptado para microescala (MENEZES et al., 2013). As análises de FAME foram realizadas num cromatógrafo de gás Varian GC (modelo 430 GC, Varian Chromatograph Systems, Walnut Creek, EUA), equipado com um auto injector CP 8412. O software Galaxie foi utilizado para quantificação e identificação dos picos. As injecções foram realizadas em uma coluna capilar de sílica fundida de 100nm (ID = 0,25 mm) revestida com 0,2 micrômetros de polietilenoglicol (SP-2560, Supelco, EUA), utilizando Hélio como gás de arraste a uma pressão isobárica de 37 psi, à velocidade linear de 20 cm/s, gás: Hélio a 29 mL/min, com razão de split de 1:50, volume
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injetado: 1,0 µL. A temperatura do injetor foi de 250°C e a temperatura do detector foi fixada a 280°C. O forno operou a temperatura inicial de 140°C durante 5 min, programado para aumentar para 240°C a uma velocidade de 4° C/min, e mantido isotermicamente durante 30 min. Composição qualitativa das amostras foi determinada por comparação dos tempos de retenção dos picos produzidos após injectar as amostras metiladas com as dos respectivos padrões de ácidos graxos. A composição quantitativa foi obtida por normalização de área e expressa como percentagem de massa, de acordo com o Método Oficial AOCS Ce 1-62. Todas as amostras foram analisadas em duplicata e os valores relatados são a média das duas corridas (SILVA et al., 2011).
4.3.4 Análises Microbiológicas