5 Overordnet lovgivning
5.1 Folkerettslige forpliktelser – EMK artikkel 8
As proteínas foram quantificadas pelo método descrito por Bradford, utilizando como padrão uma solução de albumina bovina na concentração de 0,2 mg/mL (Bradford, 1976).
Inicialmente preparou-se o reagente de Bradford 5× que foi deixado em repouso por 12 horas e depois filtrado e armazenado em frasco âmbar envolvido em papel alumínio. Em seguida fez-se uma diluição de 15× da amostra do homogenato de testículo, sendo
SOD
Pirogalol
O
2• (ânion superóxido)(auto-oxidação)
MTT oxidado MTT reduzido (amarelo) (formazan - roxo)
43 utilizados 30 µL desta com 900 µL de reagente de Bradford completando o volume com água para 1000 µL. As leituras foram feitas em 595 nm após 15 minutos da adição do reagente de Bradford.
2.5. Análises estatísticas
Análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste Student Newman-Keuls (SNK), foi usada para comparar médias entre os grupos experimentais. Todos os resultados foram expressos em média ± desvio padrão da média. A probabilidade (p) de erro menor que 0,05 foi considerada significativa.
3. Resultados
3.1. Efeitos da exposição subcrônica ao As sobre a proporção volumétrica, o volume dos elementos do intertúbulo e a morfometria da célula de Leydig
A proporção volumétrica do espaço linfático aumentou (p<0,05) nos grupos expostos ao arsênio (As1 e As2) em relação ao controle, entretanto, não se verificou alterações significativas nas proporções dos outros elementos do intertúbulo (tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, macrófagos e células de Leydig).
Tabela 1 – Proporção volumétrica (%) dos elementos no intertúbulo de camundongos adultos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Grupos Tecido conjuntivo Espaço linfático Vasos sanguíneos Macrófagos Células de Leydig Controle 7,28±3,01a 27,16±5,77a 12,38±4,89a 1,48±0,76a 51,7±3,82a As1 3,76±1,59a 50,22±16,23b 8,52±5,61a 0,82±0,41a 36,68±15,67a As2 4,86±1,82a 50,52±23,26b 9,26±3,55a 0,92±0,46a 34,44±21,19a
Valores agrupados por média ± desvio padrão.
Letras iguais nas colunas, não diferem significativamente entre si (p>0,05) (n=10). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
44 Concernente ao volume dos elementos do intertúbulo verificou-se aumento significativo do volume de células de Leydig no grupo As2 em relação ao controle e do volume de espaço linfático em As1 e As2 em comparação com o controle, não se observando alterações nos volumes dos demais componentes do intertúbulo (Tabela 2).
Tabela 2 – Volume (mL) dos elementos no intertúbulo por testículo de camundongos adultos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Grupos Tecido conjuntivo Espaço linfático Vasos sanguíneos Macrófagos Células de Leydig Controle 0,00002±0,000009a 0,0035±0,0005a 0,0017±0,0008a 0,0002±0,0004a 0,007±0,0019a As1 0,00005±0,00004a 0,0077±0,0021b 0,0014±0,0011a 0,0002±0,0001a 0,004±0,0009ab As2 0,00004±0,000004a 0,0081±0,0036b 0,0019±0,0011a 0,0002±0,0001a 0,003±0,0004b
Valores agrupados por média ± desvio padrão.
Letras iguais nas colunas, não diferem significativamente entre si (p>0,05) (n=10). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
3.2. Efeitos da exposição subcrônica ao As sobre a morfometria da célula de Leydig
Na análise morfométrica das células de Leydig, observou-se diminuição (p<0,05) do diâmetro nuclear médio nos grupos expostos às duas concentrações de As e da relação nucleoplasmática (RNP), cuja redução foi significativa apenas no grupo As2 em relação ao controle. A proporção de núcleo e citoplasma de células de Leydig e o ILS não variaram (p>0,05) entre os tratamentos (Tabela 3).
45 Tabela 3 – Morfometria da célula de Leydig (diâmetro nuclear, proporção entre núcleo e citoplasma de células de Leydig, relação nucleoplasmática e índice leydigossomático) em testículos de camundongos adultos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Grupos Diâmetro nuclear de Leydig (µm) Núcleo de Leydig no intertúbulo (%) Citoplasma de Leydig no intertúbulo (%) RNP - Relação nucleoplasmática (%) ILS - Índice leydigossomático (%) Controle 6,91 ± 0,56a 14,5±1,48a 37,2±2,64a 38,98±2,79a 0,038±0,007a As1 6,55 ± 0,22b 9,28±3,51a 27,4±12,27a 34,46±3,97ab 0,032±0,017a As2 6,48 ± 0,24b 8,66±6,11a 25,8±15,09a 31,77±5,13b 0,036±0,022a
Valores agrupados por média ± desvio padrão.
Letras iguais nas colunas, não diferem significativamente entre si (p>0,05) (n=10). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
O volume nuclear de Leydig apresentou-se diminuído (p<0,05) nos grupos As1 e As2. Entretanto, os volumes citoplasmático e de uma célula de Leydig não acompanharam esta redução, permanecendo invariados, assim como o número de células de Leydig por testículo e por grama de testículo (Tabela 4).
Tabela 4 – Morfometria da célula de Leydig de camundongos adultos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Grupos Volume nuclear (µm3) Volume citoplasmático (µm3) Volume de uma célula de Leydig (µm3) Nº de células / testículo (×106) Nº de células / grama de testículo (×106) Controle 175,91±45,55a 428,20±69,76a 604,11±107,32a 11,96±4,14a 116,24±32,45a As1 147,94±14,77b 431,78±66,11a 579,73±79,11a 10,14±4,51a 95,07±49,37a As2 142,95±15,17b 458,39±66,75a 601,34±70,10a 12,60±8,39a 98,68±63,34a
Valores agrupados por média ± desvio padrão.
Letras iguais nas colunas, não diferem significativamente entre si (p>0,05) (n=10). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
3.2. Efeito da exposição subcrônica ao As sobre a atividade enzimática de SOD e CAT testiculares
46 A atividade enzimática da dismutase do superóxido (SOD) apresentou-se aumentada (p<0,05) nos testículos dos animais que receberam arsênio em sua maior concentração (As2), em relação ao tratamento As1 e ao controle (Figura 2).
Figura 2 – Atividade da dismutase do superóxido (SOD) em testículos de camundongos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Médias (± erro padrão) seguidas de letras iguais não diferem significativamente entre si (p 0,05). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
Análises estatísticas revelaram que a administração de baixas doses de arsênio (As1 e As2) diminuíram significativamente a atividade da catalase (CAT) em homogenatos de testículo de animais tratados (As1 e As2) quando comparado com animais que administraram apenas água (Controle) (Figura 3).
Figura 3 – Atividade da catalase (CAT) em testículos de camundongos, após administração oral de arsenato de sódio por 42 dias.
Médias (± erro padrão) seguidas de letras iguais não diferem significativamente entre si (p 0,05). Controle: água potável; As1: solução de arsênio 0,05 mg/L; As2: solução de arsênio 1,0 mg/L.
- 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
Controle As1 As2
D is m u ta se d o S u p e ró x id o (u n id a d e s / m g d e p ro te ín a ) Grupo a b a 0 10 20 30 40 50 60 70
Controle As1 As2
C a ta la se (µ m o l H2 O2 / m in / m g p ro te ín a ) Grupo a c b
47
4. Discussão
4.1. Efeito da exposição subcrônica ao As sobre a proporção volumétrica e volume dos elementos do intertúbulo e sobre a morfometria da célula de Leydig
O compartimento intertubular representa a porção endócrina do testículo e, embora o arranjo e a proporção dos seus diferentes componentes variem sobremaneira entre as diferentes espécies, é o responsável pela manutenção dos níveis fisiológicos de andrógenos no fluido intersticial e na circulação sanguínea (Fawcett et al., 1973).
Segundo Jana et al. (2006) e Mehranjani e Hemadi (2007), a exposição ao arsenito de sódio determina inibição da androgênese testicular em ratos, a qual é exercida pelas células de Leydig. Aproximadamente 90% da testosterona no sangue são produzidas pelas células de Leydig e, por isso, modificação em sua morfologia pode levar a efeitos sobre a espermatogênese (Chen et al., 2011). Este hormônio é necessário para iniciação da espermatogênese na puberdade e para manutenção desse processo no adulto, sendo requerido para finalização da meiose e para diferenciação das espermátides (Castro et al., 2002; Liu e Handelsman, 2003).
O tratamento com arsenato de sódio não causou alteração na proporção de células de Leydig no intertúbulo, nem no volume das mesmas no testículo. Estudos correlacionando estrutura e função das células de Leydig mostraram que variações na secreção de testosterona resultam mais da capacidade individual da célula de Leydig de secretar testosterona do que de diferenças no volume total das mesmas no testículo (Ewing et al., 1979). Esta capacidade está altamente associada à quantidade de retículo endoplasmático liso presente na célula de Leydig e ao seu volume nuclear (Zirkin et al., 1980; Castro et al., 2002).
Os vasos linfáticos possuem capacidade de se remodelar (plasticidade) (Karpanen et al., 2006), portanto, o aumento significativo observado na proporção de espaço linfático nos animais que receberam solução de arsênio (As1 e As2) deve ser devido ao espaço deixado pela diminuição dos outros componentes do intertúbulo, principalmente das células de Leydig, elemento mais abundante no compartimento intertubular. No testículo há uma vasta rede de vasos linfáticos sinusóides que desempenha papel importante na nutrição e fornecimento de andrógenos aos túbulos seminíferos, mantendo adequadas as concentrações de andrógenos (Creasy, 2001; Foley, 2001), tendo também a habilidade de
48 drenar fluidos extracelulares e mover para fora dos testículos materiais vascularmente secretados (Fawcett et al., 1973).
Ação do As no testículo pode gerar estresse oxidativo celular, aumentando a produção de intermediários reativos de oxigênio (ROI’s). Estas substâncias influenciam a liberação de fatores proinflamatórios pelos macrófagos e, dependendo da intensidade do estresse, podem levar à redução na proporção das células de Leydig (Papadopoulos, 2007), redução essa observada de forma não significativa no presente trabalho. Durante o desenvolvimento testicular, mudanças na morfologia das células de Leydig ocorrem de maneira coordenada com os macrófagos, demonstrando íntima relação entre estas células. Assim, entende-se que fatores secretados pelos macrófagos controlam de um modo parácrino a atividade esteroidogênica e o desenvolvimento das células de Leydig (Hales, 1996). Enquanto o número de macrófagos da maioria dos órgãos aumenta pela migração de monócitos sanguíneos para os tecidos periféricos, o número de macrófagos testicular aumenta principalmente por proliferação, não sendo este aumento mediado pela testosterona (Raburn et al., 1993).
A redução observada no volume nuclear das células de Leydig, reflexo da diminuição significativa no diâmetro nuclear, não foi acompanhada pela redução do volume citoplasmático e celular. Segundo Castro et al. (2002), o volume nuclear da célula de Leydig está fortemente relacionado à concentração de testosterona testicular e plasmática e assim, esta redução no volume nuclear está ligada à redução da atividade nuclear das células de Leydig e, provavelmente, acarreta redução significativa nas concentrações testiculares ou plasmáticas de testosterona nos grupos expostos ao As. Em ratos tratados com arsenito de sódio (30 e 40 mg/L), o diâmetro nuclear das células de Leydig reduziu gradativamente em 45 e 60 dias, sendo observada também redução na população destas células (Sarkar et al., 2008). Em tratamento de camundongos com solução de arsênio (100 mg/L), constatou-se que a redução do volume nuclear da célula de Leydig causou diminuição significativa nas concentrações plasmáticas de testosterona (Mata, 2009).
Segundo Castro et al. (2002), não há correlação entre altas concentrações de testosterona e aumento da atividade espermatogênica, sendo possível que as concentrações deste hormônio só precisem alcançar, ou exceder, um certo nível limiar para que a espermatogênese proceda normalmente. Assim sendo, baixas concentrações de testosterona são ser especialmente danosas para a reprodução.
49 Juntamente com a massa corporal, o volume individual e total de células de Leydig no parênquima testicular e o número total desta célula no testículo não variaram nos animais expostos ao As, refletindo na conservação do ILS, um parâmetro que visa quantificar o investimento da massa corporal na produção de células de Leydig. O valor estimado de ILS para camundongos é de 0,03% (Russell, 1996).
Assim, diante das alterações observadas na célula de Leydig, no referido tempo de exposição, sugerimos que pode ter havido redução significativa na androgênese. Entretanto, dados provenientes de análise plasmática de andrógenos e da morfometria de organelas, como o retículo endoplasmático liso, poderiam constatar com maior precisão alterações relacionadas à produção androgênica.
4.2. Efeito da exposição subcrônica ao As sobre a atividade da dismutase do superóxido (EC 1.15.1.1) e catalase (EC 1.11.1.6) no testículo
O As tem potencial de favorecer o aumento da síntese de SOD e CAT, ativando o complexo protéico NF-k , que participa da transcrição de DNA e está envolvido em respostas celulares a estímulos como o estresse, radicais livres, etc. (Bartosz, 1990). Se a exposição persistir por períodos longos, dependendo da dose e da via administrada, podem ocorrer alterações em fatores de transcrição, como inibição de NF-k , levando à formação excessiva de radicais livres (De Vizcaya-Ruiz et al., 2009) a ponto de gerar estresse oxidativo, diminuindo assim as defesas antioxidantes enzimáticas da célula. No presente trabalho, a verificação de aumento na atividade da SOD nos testículos indica a participação ativa desse sistema enzimático no combate à ação oxidativa dos intermediários reativos de oxigênio, gerados em decorrência da exposição dos animais ao As.
A resposta antioxidante ao As parece ser tempo-dependente visto que as atividades de SOD e CAT crescem inicialmente, mas declinam depois de exposição prolongada (De Vizcaya-Ruiz et al., 2009), lembrando que a concentração administrada também é um fator que influencia a resposta. Há indicação que o grau tóxico de manifestação de diferentes substâncias depende da dose, duração, via de administração, dentre outros fatores fisiológicos (Al-Attar, 2011).
Nandi et al. (2006) verificaram aumento inicial (na quarta semana) nas atividades enzimáticas de SOD e CAT nos rins e no fígado de animais tratados com solução de arsenito de sódio (10 ppm) em relação ao controle, seguido de diminuição na décima
50 segunda semana de exposição. Os autores propuseram que a diminuição pode ter sido devido à redução da síntese ou sobreutilização de enzimas antioxidantes em decorrência do persistente estresse tóxico. Assim, concluíram que exposição a baixas doses de As por um curto período de tempo causa ativação da defesa antioxidante intrínseca, mas que o prolongamento da exposição pode afetar negativamente esse mecanismo de defesa.
Apesar do nosso ensaio ter sido com testículo, e não com rim ou fígado, podemos inferir que o significativo (p<0,05) aumento da atividade de SOD nos testículos do grupo As2 em relação ao As1 e ao controle, ao final de 6 semanas de exposição, é atribuído ao aumento da regulação da síntese de SOD, como uma resposta de proteção contra o estresse oxidativo causado pela elevação da concentração do ânion superóxido, conforme relatado por Nandi et al. (2006).
Segundo Scandalios (2002), como o ânion superóxido e seus derivados são altamente tóxicos ao metabolismo, a ocorrência de uma atividade basal de SOD torna-se necessária à manutenção adequada dos mecanismos de proteção celular contra peroxidação dos lipídios. Como consequência da maior atividade da SOD nos testículos dos grupos tratados com As, esperava-se concomitante aumento da atividade enzimática da CAT, o que não foi confirmado pelas nossas análises.
A diminuição na atividade de CAT observada nos testículos de animais tratados com As indica que essa enzima não teve participação efetiva na eliminação de H2O2 resultante da atividade da SOD na gônada. Swathy et al. (2006) também observaram, ao final de 60 dias, diminuição da atividade da CAT nos testículos de ratos tratados com etanol (4g etanol/kg de massa corporal).
Vernet et al. (2004) consideram que a atuação da CAT torna-se importante apenas quando as concentrações de H2O2 são elevadas, podendo ser atingidas durante um grande desequilíbrio oxidativo ou durante uma superexpressão de SOD. No presente trabalho é possível que o aumento da atividade da SOD no testículo investigado tenha elevado a concentração de H2O2 no testículo, mas não a ponto de alcançar o limiar para que a resposta da CAT fosse satisfatória.
Sendo assim, presume-se que a exposição ao As no período de confinamento contribuiu para maior produção de H2O2, o qual não foi eliminado na mesma proporção com que foi produzido, já que a atividade de CAT nos grupos tratados diminuiu significativamente em relação ao controle. Desta forma, podemos sugerir uma participação
51 limitada dessa enzima nos mecanismos de eliminação de H2O2 sintetizado como resposta à toxicidade do arsênio nos testículos.
A diminuição da atividade de CAT nos testículos dos animais expostos ao As está em concordância com o observado por Sainath et al. (2011) nos testículos de ratos tratados com chumbo, quando comparados ao grupo controle. Da mesma forma, o tratamento de ratos com acetato de chumbo, diminuiu a atividade enzimática da CAT nos tecidos de rins e fígado analisados (Trivedi et al., 1998). Atividades diminuídas dessa enzima, que tem papel antioxidante, sugerem uma tendência ao aumento da peroxidação lipídica, que não foi quantificada neste trabalho.
Desta forma, os dados indicam que administração de As nas concentrações utilizadas promove alterações nas defesas enzimáticas da SOD e da CAT celulares, causando estresse oxidativo testicular, processo que desempenha um importante papel na infertilidade masculina.
5. Conclusões
As doses de arsênio afetaram os parâmetros morfométricos do compartimento intertubular, especialmente no grupo exposto à maior concentração. Alterações verificadas na morfometria da célula de Leydig estão associadas, principalmente, com o comprometimento da esteroidogênese.
Administração de As provocou alteração nas defesas antioxidantes de SOD e CAT no testículo, permitindo sugerir que houve aumento na produção de H2O2 pela SOD concomitantemente a uma diminuição de defesa antioxidante de CAT, ocasionando o processo conhecido como estresse oxidativo, um dos primeiros sinais da toxicidade desse elemento químico no órgão.
Os dados apresentados indicam que ingestão subcrônica de As provoca alterações nas defesas enzimáticas do testículo e afeta sua porção endócrina, promovendo modificações na histologia do compartimento intertubular que conduzem a mudanças na atividade esteroidogênica.
52
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