3.4.1. Células K562, MDA-MB-231 e MCF-7
Os testes para a célula K562 foram realizados no Departamento de Química da UFMG, em colaboração com a Profa Dra. Elene Cristina Pereira Maia. A atividade citotóxica (IC50)
foi realizada frente a uma linhagem celular K562, que foi adquirida em um Banco de Células do Rio de Janeiro (número CR083 do acervo do BCRJ). Para realizar este teste as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co.) suplementado com 10% de soro fetal bovino (CULTILAB, São Paulo, Brasil) a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As culturas cresceram exponencialmente de 105 células mL–1 para
cerca de 8 × 105 células mL–1 em três dias. A viabilidade celular foi verificada por exclusão, utilizando corante azul de tripan (que cora somente as células mortas), e o número de células viáveis foram determinadas em um contador de partículas (modelo 22, série AK32252 da BECKMAN COULTER). Para o estudo citotóxico, 1 × 105 células mL–1 foram incubadas por 72h na ausência e presença de diferentes concentrações dos compostos testados (complexos e ligantes livres). A sensibilidade para os compostos foi avaliada pela concentração necessária para inibir o crescimento celular em 50%, (IC50). Soluções estoque
foram preparadas em DMSO e diluídas com o intuito de obter a concentração ideal para ser utilizada nos ensaios citotóxicos. A concentração final de DMSO nos experimentos foi inferior a 0,5% e foi verificado que nessas condições o solvente não tem nenhum efeito sobre a viabilidade ou o crescimento celular.
Os testes para célula MDA-MB-231 e MCF-7 foram realizados no Instituto de Genética e Bioquímica da UFU, em colaboração com a Profa Dra. Françoise Vasconcelos Botelho. A atividade citotóxica (IC50) foi realizada da seguinte forma: células MDA-MB-231
Células do Rio de Janeiro. Para realizar o teste as células de MDA-MB-231 e MCF-7 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades mL–1 de penicilina, 100 mg mL–1 de estreptomicina, a 37 °C e pH=7,4 com atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 até atingir 80% de confluência para realizar os
ensaios. O descolamento das células para efetuar a subcultura ou plaqueamento foi realizado utilizando uma solução de tripsina:EDTA para células MCF-7 e uma solução de EDTA para células MDA-MB-231, durante 5 minutos. Em seguida, a tripsina foi inativada aplicando-se o meio de cultura e as células foram lavadas três vezes com este meio de cultivo. A determinação do número de células viáveis foi efetuada em uma câmara de Neubauer. Para o estudo citotóxico, 5 × 104 células mL–1 foram incubadas por 36 h na ausência e presença de diferentes concentrações dos compostos testados (complexos e ligantes livres). A sensibilidade para os compostos foi avaliada pela concentração necessária para inibir o crescimento celular em 50%, (IC50). Soluções estoque dos compostos em estudo foram
preparadas em DMSO.
3.4.2. Determinação do tipo de morte celular
Os testes para determinação do tipo de morte celular foram realizados no Instituto de Genética e Bioquímica da UFU, em colaboração com a Profa Dra. Françoise Vasconcelos Botelho. Para o ensaio de morte celular foi utilizado o kit Annexin V/Dead Cell (Thermo Fisher scientific) que contém o corante Isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado com a Anexina-V que é capaz de detectar a fosfatidilserina na membrana externa de células apoptóticas e um corante 7-AAD que proporciona informação sobre a integridade da membrana ou da morte celular. O corante 7-AAD é excluído de células vivas saudáveis, bem como células apoptóticas precoces. Para realizar este teste as células MDA-MB-231 foram semeadas em uma placa de cultura de 24 poços com uma densidade de 3 × 105 células/poço e
foram cultivadas durante a noite em meio RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino. No dia seguinte, as células foram incubadas na presença de 50 µmol L–1 dos complexos 1 e 3. Após 24 horas de tratamento com os complexos de cobre(II), as células MDA-MB-231 foram colhidas pelo processo de tripsinização e em seguida foram acrescentados os marcadores presentes no kit Annexin V/Dead Cell. As células foram então incubadas no escuro e em temperatura ambiente durante 15 min, e posteriormente foi feito à aquisição dos dados em um citômetro de fluxo (FACSCallibur, BD Biosciences).
3.4.3. Interação com DNA
Os ensaios para determinar o tipo de interação dos complexos com o DNA foram realizados por espectroscopia na região do UV-Vis e por dicroísmo circular. As amostras foram preparadas em tampão HEPES, pH = 7,3 e I = 1×10–3 mol L–1. Para realizar estes estudos, uma solução de DNA de timo de vitelo (CT-ADN) foi preparada em tampão Hepes e a sua concentração foi determinada através dos dados de absorbância obtidos no espectro de UV-Vis, pois a absortividade molar para o CT-DNA é 6600 mol–1 L cm–1 em 260 nm (RAHBAN et al., 2010). Os cálculos foram feitos através da lei de Lambert-Beer. Os espectros de absorbância na região do UV-Vis foram obtidos utilizando-se um espectrofotômetro Cary100 Varian. As soluções dos complexos foram preparadas na concentração 2,5 × 10–5 mol L–1 e a concentração de DNA adicionada a estas soluções variou de 0 a 3 × 10–4 mol L–1. Os espectros de dicroísmo circular (CD) foram obtidos utilizando-se um espectropolarímetro Jasco J-815. As soluções de DNA foram preparadas na concentração 1,0 × 10–4 mol L–1 e a concentração dos complexos adicionados a esta solução variou de 0 a 3,2 × 10–4 mol L–1.
3.4.4. Avaliação da atividade tripanocida in vitro
Os testes para atividade tripanocida foram realizados no Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, em colaboração com a pesquisadora Dra. Zumira A. Carneiro e o Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque. A atividade tripanocida in vitro dos compostos em estudo foi avaliada contra a forma amastigota da estirpe infecciosa CL Brener (BUCKNER et al., 1996). Resumidamente, as células L929 (2,5 × 104 células mL–1) foram
ressuspendidas em meio RPMI sem vermelho de fenol, suplementado com 5% de soro fetal bovino e posteriormente foram semeadas em placas de 96 poços. Após 3 horas, as células foram infectadas com 5,0 × 105 tripomastigotas da estirpe CL Brener do T. cruzi, expressando
de forma estável o gene da β-galactosidase da Escherichia coli (clone B5 da estirpe CL Brener), e em seguida foram incubadas por 48 horas. Após 48 horas de infecção, as placas foram lavadas sucessivamente para retirar a forma tripomastigota do T. cruzi presente no sobrenadante, assim permaneceram apenas as células contendo a forma amastigota (forma intracelular do parasito). As células infectadas com as formas intracelulares do parasito
(amastigota) foram incubadas com os compostos testados, em concentrações seriadas variando de 500 mol L–1a 3,λ mol L–1. O benzonidazol foi utilizado como controle positivo e os meios de cultura como controle negativo. Após 72 horas, adicionou-se 50 L de PBS (solução salina tamponada com fosfato) contendo 0,3% de Triton X-100, para lise das células e 400 mol L–1 de CPRG (do inglês Chlorophenol Red-β-D-galactoside), como substrato para a β-galactosidase. As placas foram incubadas a 37 °C durante 6 h e absorbância foi lida em 570 nm. Quanto maior a quantidade de parasitos nos poços de cultura, maior será a conversão da CPRG pela β-galactosidase e, consequentemente, maior a absorbância no espectrofotômetro.
3.4.5. Avaliação in vitro da citotoxicidade em células normais
Os estudos de citotoxicidade em células normais foram realizados no Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Universidade de São Paulo, em colaboração com a pesquisadora Dra. Zumira A. Carneiro e o Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque. A dosagem letal necessária pra matar 50% das células (DL50) foi realizada
perante a linhagem de células normais de fibroblastos L929. A viabilidade das células L929 (fibroblastos) foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico clássico [3 - (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difenil tetrazólio brometo] (MTT) (MOSMANN,1993). Para o estudo citotóxico, 2,5 × 104 células foram incubadas durante 24 horas em placas de 96 poços. Após este período, o benzonidazol ou os compostos em estudo foram adicionados em concentrações variando de 500 a 3,95 mol L–1(diluição em série), com um volume final de 200 L. As soluções foram previamente preparadas em 0,5% de DMSO (v/v). As células foram incubadas a 37 °C durante 72 horas. Após o período de incubação com os ligantes e os seus respectivos complexos, o meio de cultura foi removido e adicionou-se 50 L do corante MTT (5,0 mg/mL) previamente diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O corante MTT forma um precipitado azul-violeta (formazan) que foi então dissolvido em 50 L de DMSO e posteriormente foi realizada a leitura de absorbância em 570 nm utilizando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi expressa como a percentagem dos valores de absorção em células tratadas comparados com as células não tratadas (controle).