Final Suggestion of the Test Rig Design

O espectro de Raman coletado das fibras não processadas formadas a partir da proteína rNcFlag2222 está mostrado na Figura 5. É possível observar regiões entre 800 and 1800 cm-1 que contêm bandas características de resíduos de aminoácidos da proteína recombinante. A banda 1415 cm-1 indica a presença resíduos de glicina nas proteínas (Lefèvre et al., 2012), e está visível no espectro da fibra Flag sintética já que 46% do total de aminoácidos desta proteína recombinante são de resíduos de glicina. Embora, a proteína rNcFlag2222 possua apenas 1,5% de resíduos de tirosina e menos de 1 % de resíduos de fenilalanina, a presença destes pode ser detectada pela apresentação das bandas de 1615 cm-1 e de 1003 cm-1, respectivamente (Lefèvre et al., 2012).

Como proposto para as proteínas glúten e elastina (Urry et al., 1995; Van Dijk, 1997), o pentapeptídeo GPGGX presente nas proteínas de aranha conferem elasticidade à fibra por meio das estruturas do tipo β-turn. Estas formam “nanomolas” em espirais β, com cada volta da espiral contendo dois motivos do pentapeptídeo (Hayashi e Lewis, 2001; Becker et al., 2003; Porter et al., 2005). Porém, estudos de ressonância magnética nuclear (RMN) em peptídeos presentes na Flag (GGPGGA)6G (Ohgo et al., 2006) e análises de

dicroísmo circular comparando proteínas Flag recombinantes com peptídeos GPGGA (Teulé et al., 2007) indicam que o motivo GPGGX adota uma conformação randômica e não uma estrutura do tipo espiral β. Na seda flageliforme uma região espaçadora está presente entre as unidades básicas repetitivas, essa sequência não é típica de seda de aranha já que não é rica em glicina e contém predominantemente resíduos de aminoácidos carregados e

hidrofílicos (Hayashi e Lewis, 2001). A função e estrutura dessa região ainda são desconhecidas.

O espectro de Raman da fibra rNcFlag2222 mostrou a presença de uma banda larga de amida I no intervalo de 1600-1700 cm-1, como já mostrado em outras análises feitas com a seda flageliforme nativa (Lefèvre et al., 2012). A análise da região amida I do espectro de sedas tem se mostrado muito informativa para as estruturas de fibras nativas de aranhas (Zhou et al., 2004; Rousseau et al., 2009; Lefèvre et al., 2012). De acordo com o espectro de Raman das fibras sintéticas (Figura 4), a banda amida I da proteína rNcFlag2222 é larga e o seu pico está em 1659 cm-1, um pouco abaixo do reportado para sedas flageliformes nativas (Lefèvre e Pezolet, 2012). O fato do pico da banda amida I ser largo indica a presença de uma mistura heterogênea de estruturas secundárias, como já foi sugerido para proteínas Flag nativas (Rousseau et al., 2009; Lefèvre et al., 2012). Nessa região foram encontrados sinais de estruturas random coil (1641 cm-1), α-hélices/helices PPII (1656 cm-1), folha-β (1670 cm-1) e β-turns (1685 cm-1) (Lefèvre et al., 2012). O pico mais proeminente e definido de todas as estruturas identificadas na região amida I é o que representa as estruturas helicoidais (α-hélices/helices PPII). Embora nenhuma quantificação estrututal tenha sido feita, a banda amida I da proteína rNcFlag2222 está localizada mais abaixo (1659 cm-1), quando comparada com análises feitas em sedas flageliformes nativas (1668 a 1670 cm-1). Essa mudança na posição da região amida I ocorreu devido a intensidade do pico relativo às estruturas helicoidais. Esse deslocamento pode estar relacionado ao fato da proteína rNcFlag2222 possuir duas regiões espaçadoras e também pela presença do domínio GGX (Hayashi e Lewis, 2001; Rising et al., 2005; Teulé et al., 2012a).

Por outro lado, o pico relativo a estrutura β-turn é o mais largo e está relacionado a presença do polipeptídeo GPGGX presente na rNcFlag2222, que é responsável pela natureza elástica das sedas de aranha (Hayashi e Lewis, 2001; Teulé et al., 2012a). Nenhum modelo ainda tinha proposto a presença de folhas-β na seda flageliforme por várias razões: 1) esta seda possui uma força tensora pequena e uma extraordinária elasticidade quando comparada a seda

linha de segurança, 2) a proteína Flag é rica em resíduos de prolina que não são favoráveis a formação de folhas-β (Rousseau et al., 2009) e 3) a ausência de motivos que formam folhas-β como poli(A) e poli(GA) (Teulé et al., 2007; An et al., 2011; Teulé et al., 2012a; Teulé et al., 2012b; Miao et al., 2012). Porém Lefèvre e Pezolet (2012) publicaram recentemente um estudo feito em fibras flageliformes usando espectroscopia Raman, mostrando que embora inesperado, a seda da Flag contem algumas folhas-β e exibe um certo nível de orientação ao longo do eixo da fibra e que a região espaçadora (ou outros tipos de proteínas da seda) pode estar envolvida na formação dessas folhas-β.

Os dados de WAXS coletados da fibra rNcFlag2222 (Figura 5) mostraram dois anéis com centros em 4.4 e 10.5 Å. Esse padrão de dois anéis é característico de estruturas helicoidais e de folhas-β (Hauser et al., 2011). O anel

de 10.5 Å é característico de fibras Flag sintéticas (Dra. Florence Teulé, Utah State University, comunicação pessoal) e o anel com centro em 4.4 Å é consistente com a estrutura amorfa e desordenada da fibra (Teulé et al., 2012) e sugere que a estrutura da proteína rNcFlag2222 seja dominada por estruturas helicoidais do tipo hélice PPII, devido ao fato da região espaçadora dessa proteína estar duplicada.

Os dados apresentados sugerem que a extrusão da fibra sintética em HFIP (solvente conhecido por promover a formação de estruturas helicoidais) pode ser a causa da agregação dessas hélices em folhas-β inesperadas, provavelmente na região espaçadora. Como não foi possível processar a fibra para se ter mais dados estruturais que provassem que as estruturas folhas-β permaneceriam após o processamento e assim eliminar qualquer artefato do método de extrusão utilizado, não se pode afirmar que o componente helicoidal é responsável pela formação de folhas-β.

Figura 4. Espectro Raman (acima) e decomposição espectral da região amida I (abaixo) da fibra sintética rNcFlag2222. Estruturas: random coil (1641 cm-1), α- hélices/helices PPII (1656 cm-1), folha-β (1670 cm-1) e β-turns (1685 cm-1) (Lefèvre et al., 2011).

Figura 5. Análise de dispersão de raios x de grandes ângulos da fibra sintética não processada rNcFlag2222. As setas apontam para dois anéis amorfos de diferentes intensidade com os centros em 4.4Å and 10.5Å.